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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 천연물 중 대나무 속껍질로서 해열 작용, 항염증 작용, 항암 작용, 진해 작용 등의 효능을 가진 것으로 알려진 죽여(Bambusae Caulis in Taeniam)를 사용하여 금 나노 입자를 합성하는 방법을 제시하였다. 게다가 죽여 추출물로 합성된 금 나노 입자가 가지는 물리화학적인 특성과 금 나노 입자의 항산화능을 조사하여 생체 사용에 적합한 기능성 소재로서의 사용 가능성을 검토하였다 (Muthukumar et al.
- 본 연구에서는 여러 종류의 천연물 중 약리활성이 우수한 죽여를 사용하여 기존의 물리, 화학적인 방법을 대체하는 친환경적인 방법으로 금 나노 입자를 합성 하여 그 특성들을 검토하였다. 일반적으로 나노기술에서의 나노물질은 100 미만의 크기를 범주로 하게 되는데, 본 연구에서 죽여로 합성한 금 나노 입자는 일반적인 크기 범주에 속하는 것으로 확인되었으며 금이 가지는 기본적인 물리, 화학적인 특성을 보유하고 있는 것을 관찰하였다.
- 나노 입자는 그들이 가지는 광학적, 기계적, 화학적인 특성들이 벌크 입자와는 전혀 다른 독특한 성질을 보유하며, 본 연구에서는 그러한 특성들을 활용하기 위하여 금 나노입자의 인체 적용과 생리활성을 바탕으로 한 유용성을 목적으로 하였다. 이러한 의도로 본 연구에서는 죽여로 합성한 금 나노 입자의 세포독성과 유용성을 검토하기 위하여 MTT assay와 DPPH 라 디컬 소거능, ABTS 소거능과 같은 항산화능 분석과 더불어 RAW 264.
제안 방법
- 24 well plate에 제조된 DPPH 용액 500 와 금나노 입자의 농도를 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml로 조정한 시료 100 μl를 반응시킨 후, Multilabel Counter(VICTOR 3, Perkin Elmer)를 이용하여 545 에서 흡광도를 측정하였다.
- 4시간 후에 상층액을 제거하고 각 well에 200 μl의 DMSO를 첨가 한 뒤 Multilabel Conuter를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Tułodziecka et al., 2016).
- RAW 264.7 대식세포를 1 × 104 cells/well의 농도로 24 well plate에 분주하여 24시간동안 37ºC에서 배양한 후 합성된 금 나노 입자가 용해된 용액을 금 나노 입자 농도별(0.1, 0.2, 0.4 mg/ml)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- 세포배양을 위하여 10% FBS가 첨가된 DMEM에 penicillin(100 U/ml)와 streptomycin(100 μg/mL)를 첨가하여 사용하였다.
- 죽여를 이용한 금 나노 입자의 합성 여부와 생성된 금나노 입자의 흡수 파장대는 UV-visible spectrophotometer(Ultrospec 6300 pro, Amersham Biosciences)를 사용하였고, 금나노 입자의 크기와 입자 안정성의 지표인 제타포텐셜(Zeta potential)을 측정하기 위하여, Zetasizer(Nano-ZS90, Malvern)을 사용하였다.
- 보다 상세한 금 나노 입자의 크기와 형태는 HR-TEM(TALOS F200X, FEI)을 이용하여 관찰하였다. 또한 금나노 입자의 구조 분석과 결정구조는 X-ray Diffraction(Empyrean series2, Panalytical)과 FT-IR spectroscopy(Spectrum GX, Perkin Elmer)를 사용하였다(Razzaq et al.
- 죽여 추출물로 합성한 금나노 입자(BCT-GNPs)의 항산화능은 DPPH 라디컬 소거능과 ABTS 라디칼 소거능으로 측정하였다. 먼저 DPPH 라디컬 소거능 측정을 위하여 메탄올과 증류수를 1:1로 혼합된 용액에 DPPH을 녹여서 최종 농도 0.
- 4 mg/ml로 조정한 시료 100 μl를 반응시킨 후, Multilabel Counter(VICTOR 3, Perkin Elmer)를 이용하여 545 에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 소거 정도를 백분율로 나타내었고, kojic acid를 양성 대조군으로 하여 비교 분석하였다(Saquib et al., 2013). 또한 화학적 합성법으로 합성된 금나노 입자와 비교하기 위하여 citrate로 합성된 금나노 입자(Cit-GNPs)를 각기 같은 농도로 비교 분석하였다.
- , 2013). 또한 화학적 합성법으로 합성된 금나노 입자와 비교하기 위하여 citrate로 합성된 금나노 입자(Cit-GNPs)를 각기 같은 농도로 비교 분석하였다.
- ABTS 라디칼 소거능의 측정은 ABTS 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 하루 동안 암실에 방치하여 ABTS・ +을 형성시켰다. ABTS・ +용액은 734 nm에서의 흡광도 값이 1.
- Cit-GNPs 역시 같은 농도와 조건으로 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 소거 정도를 백분율로 나타내었고, kojic acid를 양성 대조군으로 비교 분석하였다(Shaheen et al., 2016).
- RAW 264.7 대식세포를 1 × 104 cells/well의 농도로 24 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후 죽여(BCT)와 죽여를 이용한 금나노 입자(BCT-GNPs), 그리고 화학적 합성 금나노 입자 (Cit-GNPs) 시료를 농도별(0.1, 0.2, 0.4 mg/ml )로 처리 하여 배양하였다.
- PBST buffer로 10분간 3회 세척하고 ECL(WesternBrightTM , advansta)을 처리하여 Image Quant를 이용해 가시화하였다(Wongkrongsak et al., 2016).
- 죽여 합성 금 나노 입자(BCT-GNPs)의 보다 자세한 크기와 형태는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 HR-TEM을 이용하여 관찰하였다(Fig. 2). 대부분의 입자들은 전체적으로 모서리는 둥근면을 가진 부정형의 형태를 보였고 입자들은 개개로 잘 분산되어 있었다.
- 금 나노 입자의 세포 독성 시험을 위하여 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 MTT assay를 수행한 결과는 Fig. 6과 같았다. 합성된 금 나노 입자를 0.
대상 데이터
- 죽여를 이용하여 합성한 금 나노입자 (Gold Nanoparticles using Bambusae Caulis in Taeniam, BCT-GNPs)에 사용한 염화금(HAuCl4)과 항산화능의 측정 및 세포독성의 측정을 위하여 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS(2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)) 및 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide)는 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
- 세포배양을 위하여 사용한 배지 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)과 FBS (Fetal Bovine Serum)는 WELGENE사를 사용하였다.
- 본 실험에서 천연물 소재로 사용된 죽여(Bambusae Caulis in Taeniam, BCT)는 광명생약에서 구입하여 사용하였다. 죽여를 이용하여 합성한 금 나노입자 (Gold Nanoparticles using Bambusae Caulis in Taeniam, BCT-GNPs)에 사용한 염화금(HAuCl4)과 항산화능의 측정 및 세포독성의 측정을 위하여 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS(2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)) 및 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide)는 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
- 세포배양을 위하여 사용한 배지 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)과 FBS (Fetal Bovine Serum)는 WELGENE사를 사용하였다. Western Blot에 사용된 항체 Heme oxygenase 1과 anti-rabbit IgG는 Snata Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다(Nakkala et al., 2015).
- 실험에 사용한 RAW264.7 대식세포는 ATCC에서 분양을 받아 사용하였다. 세포배양을 위하여 10% FBS가 첨가된 DMEM에 penicillin(100 U/ml)와 streptomycin(100 μg/mL)를 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 평균(mean)±표준편차(Standard Deviation, SD)로 나타내었고, 실험 결과들은 t-test법에 따라 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 죽여로 합성한 금 나노 입자의 세포독성을 검토하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1의 A, B와 같았다. 일반적으로 금 나노 입자는 530~540 nm 파장에서 최대 흡광도를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 본 연구에서 합성된 죽여 금 나노 입자 (BCT-GNPs)는 540 nm에서 최대 흡광도를 나타내었다. 금은 100 nm 이하의 입자 크기에서부터 일반적인 황금색이 아닌 보라색으로 나타나며, 크기가 더 줄어들게 되면 보라색에서 점차적으로 적색으로 색상이 변화된다.
- 죽여(BCT)와 비교하여 죽여를 이용하여 합성한 금 나노 입자(BCT-GNPs)의 XRD pattern은 총 4개의 peak가 형성 되었는데, 2θ = 38.2, 44.4, 64.6, 77.5일 때 각각 (111), (200), (220), (311) 면을 가져 금이 가지는 면심입방격자 구조임을 확인하였다.
- 금은 100 nm 이하의 입자 크기에서부터 일반적인 황금색이 아닌 보라색으로 나타나며, 크기가 더 줄어들게 되면 보라색에서 점차적으로 적색으로 색상이 변화된다. 본 연구에서도 반응 용액의 색상 변화가 일어나는 것으로 금 나노 입자가 합성되었음을 확인하였다.
- 2 A-D). 또한 SAED pattern을 통하여 죽여로 합성된 금 나노 입자는 면심입방격자형의 결정 구조로 확인되었다(Fig. 2 E).
- 5와 같았다. 금나노 입자의 DPPH 라디칼 소거활성은 금 나노 입자의 농도가 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 로 증가함에 따라 라디컬 소거 활성 역시 각 각 42.3, 52.3, 68.8%을 나타내어 금나노 입자에 농도의존적으로 소거활성이 증가하였다. 화학적 합성 금 나노 입자(Cit-GNPs)는 소거 활성능이 상대적으로 매우 적었으며 농도별로도 차이를 보이지 않았다.
- ABTS+ 라디칼 소거활성에서도 금나노 입자의 농도를 각기 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 로 달리한 결과 각각 48.6, 67.9, 82.7%의 라디컬 소거 활성을 나타내어 죽여 금 나노 입자(BCT-GNPs)의 농도 증가에 비례하여 항산화능 또한 증가하였다. 화학적합성 금나노 입자 (Cit-GNPs)는 DPPH의 결과와 유사하게 낮은 항산화능과 농도에 따른 차이를 보이지 않았다.
- 6과 같았다. 합성된 금 나노 입자를 0.1, 0.2, 0.4 / 의 농도로 달리하여 세포 독성을 측정한 결과, 세포의 생존율이 전 농도에서 대조군과 비교하여 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 설정한 농도 내에서는 금 나노 입자가 세포 생존에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보아 세포 독성이 미미함을 확인 하였다.
- 4 / 의 농도로 달리하여 세포 독성을 측정한 결과, 세포의 생존율이 전 농도에서 대조군과 비교하여 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 설정한 농도 내에서는 금 나노 입자가 세포 생존에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보아 세포 독성이 미미함을 확인 하였다.
- 본 연구에서는 여러 종류의 천연물 중 약리활성이 우수한 죽여를 사용하여 기존의 물리, 화학적인 방법을 대체하는 친환경적인 방법으로 금 나노 입자를 합성 하여 그 특성들을 검토하였다. 일반적으로 나노기술에서의 나노물질은 100 미만의 크기를 범주로 하게 되는데, 본 연구에서 죽여로 합성한 금 나노 입자는 일반적인 크기 범주에 속하는 것으로 확인되었으며 금이 가지는 기본적인 물리, 화학적인 특성을 보유하고 있는 것을 관찰하였다.
- 나노 입자는 그들이 가지는 광학적, 기계적, 화학적인 특성들이 벌크 입자와는 전혀 다른 독특한 성질을 보유하며, 본 연구에서는 그러한 특성들을 활용하기 위하여 금 나노입자의 인체 적용과 생리활성을 바탕으로 한 유용성을 목적으로 하였다. 이러한 의도로 본 연구에서는 죽여로 합성한 금 나노 입자의 세포독성과 유용성을 검토하기 위하여 MTT assay와 DPPH 라 디컬 소거능, ABTS 소거능과 같은 항산화능 분석과 더불어 RAW 264.7 대식세포에서 항산화에 관여하는 주요 단백질인 HO-1의 금 나노 입자의 농도 증가에 따른 발현 변화가 비례적으로 증가함을 확인하였다.
후속연구
- 추후 죽여(BCT)와 죽여를 이용하여 합성한 금나노 입자(BCT-GNPs)에 대한 HO-1에 관려된 신호전달 체계에 대한 폭 넓은 연구가 진행되어야 죽여로 합성된 금나노 입자의 특이성과 유용성을 상세히 밝힐 수 있을 것으로 보인다. 실제로 세포내에서 천연물에서는 나타나지 않는 현상이 그 천연물을 이용한 금나노 입자에서는 특이적인 유용 현상이 발생하는 것이 확인되었다(Chae et al.
- 따라서 일정 수준에서 독성을 나타내지 않는 수준에서의 천연물 이용 금나노 입자는 생체진화적인 소재로서 활용의 범위가 넓을 것으로 기대된다. 본연구에서의 죽여를 이용한 금나노 입자(BCT-GNPs)도 항산화능을 보유하고 있고 세포독성이 없어 인체에 적절하게 사용할 수 있는 유용 생리활성 소재 후보로서 활용이 가능할 것으로 보인다.
- 따라서 일정 수준에서 독성을 나타내지 않는 수준에서의 천연물 이용 금나노 입자는 생체진화적인 소재로서 활용의 범위가 넓을 것으로 기대된다. 본연구에서의 죽여를 이용한 금나노 입자(BCT-GNPs)도 항산화능을 보유하고 있고 세포독성이 없어 인체에 적절하게 사용할 수 있는 유용 생리활성 소재 후보로서 활용이 가능할 것으로 보인다.
- 따라서 죽여 추출물을 사용하여 친환경적인 방법으로 합성된 금 나노 입자는 본 연구결과에 보는 바와 같이 인체적용에 적합한 기능성을 가진 유용물질 소재로서 활용이 가능할 것으로 보인다. 또한 환경 친화적인 방법으로 합성이 되기에 기존의 물리화학적인 방법에 의해 합성되는 금 나노 입자들에 비하여 합성 공정의 측면에서 안정성과 생체 친화적 측면에서 다양한 응용분야에 적용이 가능할 것으로 보인다.
- 따라서 죽여 추출물을 사용하여 친환경적인 방법으로 합성된 금 나노 입자는 본 연구결과에 보는 바와 같이 인체적용에 적합한 기능성을 가진 유용물질 소재로서 활용이 가능할 것으로 보인다. 또한 환경 친화적인 방법으로 합성이 되기에 기존의 물리화학적인 방법에 의해 합성되는 금 나노 입자들에 비하여 합성 공정의 측면에서 안정성과 생체 친화적 측면에서 다양한 응용분야에 적용이 가능할 것으로 보인다.
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