본 연구에서는 우산고로쇠(Acer okamotoaum) methanol (MeOH) 추출물과 n-BuOH, ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride 및 n-hexane의 4종 분획물을 이용하여 free radical 소거능과 총 페놀, 플라보노이드 함량을 통한 항산화 효과를 측정하였으며, 신경교세포인 C6 glial cell을 이용하여 amyloid $beta_{25-35}$ ($A{\beta}_{25-35}$)에 의해 유도된 산화적 스트레스에서 신경세포 보호 효과에 대해 알아보았다. 그 결과 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물은 우수한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 소거능을 나타내었으며, 특히 EtOAc 분획물은 $4.47{\mu}g/mL$의 $EC_{50}$ 값을 나타내 가장 우수한 소거능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. Superoxide radical 소거능에서도 MeOH 추출물과 분획물은 높은 소거능을 보였으며, EtOAc 분획물은 $100{\mu}g/mL$ 농도에서 84.60%로 가장 높은 소거능을 나타내었다. 총 페놀과 플라보노이드 함량에서도 EtOAc 분획물은 다른 추출물과 분획물에 비해 월등히 높은 함량을 가지는 것으로 확인 되었다. 또한 $A{\beta}_{25-35}$에 의해 유발된 산화적 스트레스에서 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물은 세포 생존율을 증가시켰으며, reactive oxygen species 생성을 감소 시키는 것으로 확인되었고 EtOAc 분획물이 가장 뛰어난 효과를 나타내었다. 본 연구 결과를 통해 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물, 특히 EtOAc 분획물은 우수한 항산화 효과와 산화적 스트레스의 개선 효과를 가져 신경세포 보호에 효과가 있는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 우산고로쇠(Acer okamotoaum) methanol (MeOH) 추출물과 n-BuOH, ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride 및 n-hexane의 4종 분획물을 이용하여 free radical 소거능과 총 페놀, 플라보노이드 함량을 통한 항산화 효과를 측정하였으며, 신경교세포인 C6 glial cell을 이용하여 amyloid $beta_{25-35}$ ($A{\beta}_{25-35}$)에 의해 유도된 산화적 스트레스에서 신경세포 보호 효과에 대해 알아보았다. 그 결과 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물은 우수한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 소거능을 나타내었으며, 특히 EtOAc 분획물은 $4.47{\mu}g/mL$의 $EC_{50}$ 값을 나타내 가장 우수한 소거능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. Superoxide radical 소거능에서도 MeOH 추출물과 분획물은 높은 소거능을 보였으며, EtOAc 분획물은 $100{\mu}g/mL$ 농도에서 84.60%로 가장 높은 소거능을 나타내었다. 총 페놀과 플라보노이드 함량에서도 EtOAc 분획물은 다른 추출물과 분획물에 비해 월등히 높은 함량을 가지는 것으로 확인 되었다. 또한 $A{\beta}_{25-35}$에 의해 유발된 산화적 스트레스에서 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물은 세포 생존율을 증가시켰으며, reactive oxygen species 생성을 감소 시키는 것으로 확인되었고 EtOAc 분획물이 가장 뛰어난 효과를 나타내었다. 본 연구 결과를 통해 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물, 특히 EtOAc 분획물은 우수한 항산화 효과와 산화적 스트레스의 개선 효과를 가져 신경세포 보호에 효과가 있는 것으로 확인되었다.
Radical scavenging effect and protective activity against oxidative stress of Acer okamotoanum were investigated. A. okamotoanum was extracted with methanol (MeOH) and then fractionated with n-BuOH, ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride and n-hexane fractions. The MeOH extract and fractions show...
Radical scavenging effect and protective activity against oxidative stress of Acer okamotoanum were investigated. A. okamotoanum was extracted with methanol (MeOH) and then fractionated with n-BuOH, ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride and n-hexane fractions. The MeOH extract and fractions showed strong 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and superoxide radical scavenging activity. Among the MeOH extract and fractions, the EtOAc fraction showed the strongest radical scavenging activity. In addition, total phenolic and flavonoid contents of EtOAc fraction was higher than other extract and fractions. Furthermore, we investigated the neuroprotective effect of the MeOH extract and fractions from A. okamotoanum against oxidative stress under cellular system using C6 glial cell. The C6 glial cells showed a decrease in cell viability and high production of reactive oxygen species (ROS) by the treatment of amyloid $beta_{25-35}$ ($A{\beta}_{25-35}$). However, with the treatment of the MeOH extract and fractions, it significantly increased the cell viability and inhibited the overproduction of ROS by $A{\beta}_{25-35}$. In particular, the EtOAc fraction led to significantly increase the cell viability and decrease the generation of ROS against oxidative stress by $A{\beta}_{25-35}$. The current study indicated that A. okamotoanum demonstrated antioxidative and neuroprotective effects. In particular, the EtOAc fraction which attributed a strong protective activity against oxidative stress.
Radical scavenging effect and protective activity against oxidative stress of Acer okamotoanum were investigated. A. okamotoanum was extracted with methanol (MeOH) and then fractionated with n-BuOH, ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride and n-hexane fractions. The MeOH extract and fractions showed strong 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and superoxide radical scavenging activity. Among the MeOH extract and fractions, the EtOAc fraction showed the strongest radical scavenging activity. In addition, total phenolic and flavonoid contents of EtOAc fraction was higher than other extract and fractions. Furthermore, we investigated the neuroprotective effect of the MeOH extract and fractions from A. okamotoanum against oxidative stress under cellular system using C6 glial cell. The C6 glial cells showed a decrease in cell viability and high production of reactive oxygen species (ROS) by the treatment of amyloid $beta_{25-35}$ ($A{\beta}_{25-35}$). However, with the treatment of the MeOH extract and fractions, it significantly increased the cell viability and inhibited the overproduction of ROS by $A{\beta}_{25-35}$. In particular, the EtOAc fraction led to significantly increase the cell viability and decrease the generation of ROS against oxidative stress by $A{\beta}_{25-35}$. The current study indicated that A. okamotoanum demonstrated antioxidative and neuroprotective effects. In particular, the EtOAc fraction which attributed a strong protective activity against oxidative stress.
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문제 정의
따라서 본 실험에서는 우산고로쇠의 methanol (MeOH) 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물을 이용하여 항산화 효과를 in vitro 라디칼소거능과 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 통해 알아보았으며, 신경세포인 C6 glial cell을 이용하여 amyloid beta25-35 (Aβ25-35)에 의해 유도된 산화적 스트레스에서 우산고로쇠의 신경세포 보호 효과를 연구함으로써 우산고로쇠의 우수성과 천연 기능성 물질로서의 가능성에 대해 검토해 보았다.
본 연구에서는 신경교세포인 C6 glial cell에 Aβ25-35를 처리하여 유도된 산화적 스트레스에 대한 우산고로쇠의 신경세포 보호 효과를 알아보았다.
가설 설정
5, 1 μg/mL가 되도록 처리하였고, BuOH, EtOAc, MC 분획물은 최종농도가 5, 25, 50, 100 μg/mL가 되도록 처리하여 2시간 배양하였다. 실험에 사용된 각 시료의 처리농도는 사전 연구를 통해 독성이 없는 농도 범위로 정하였다. Aβ25-35 (25 μM)를 처리하여 24시간 배양 후, 각 well에 5 mg/mL의 MTT 200 μL씩을 주입하여 37 oC에서 4시간 재배양하였다.
제안 방법
20 μM의 DCF-DA용액 200 μL를 각 well에 주입하여 30분간 배양 후 FLUO star OPTIMA (BMG labtech, Ortenberg, Germany) excitation-480 nm, emission-535 nm를 이용하여 ROS 생성량을 측정하였다(Ma 등, 2013).
4시간 후 MTT를 제거하고 DMSO 200 μL을 각 well에 주입하여 생성된 formazan 결정을 30분간 빛이 차단된 상태에서 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Mosmann 1983).
다음으로 120 μM PMS를 0.75 mL 첨가하여 5분간 NBT의 소거를 유도한 후 흡광도 560 nm에서 소거능을 측정하였다.
따라서 플라보노이드 함량 측정은 항산화 효능을 알아보는데 밀접한 관련이 있어 항산화 기능성을 미리 예측해 볼 수 있다. 본 실험에서 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물의 플라보노이드 함량 측정은 quercetin을 기준물질로 하여 측정하였다. MeOH 추출물은 101.
자연계에 널리 분포하고 있는 대표적인 항산화 성분인 페놀은 phenolic hydroxyl기를 가지는 2차 대사산물로 다양한 구조 및 분자량을 가지고 있으며 항암, 항염증 및 항알레르기 작용 뿐 아니라 항산화 효과도 뛰어나 free radical에 의해 유발되는 다양한 질병의 예방 및 치료에 효과를 가지며 특히 식물에 함유된 페놀은 항산화 활성이 뛰어난 것으로 알려져 있다(Duthie과 Crozier 2000; Kim 등, 2005; Ferreres 등, 2009). 본 연구에서 총 페놀 함량을 tannic acid를 표준물질로 하여 실험을 진행하였다. Tannic acid equivalent 페놀 함량을 살펴본 결과, MeOH 추출물은 192.
세포가 flask에서 confluence 상태가 되면 96-well plate에 5×104 cells/well로 seeding하여 세포를 부착시키기 위해 37oC에서 4시간 배양한 후, MeOH 추출물과 Hx 분획물은 최종농도가 0.05, 0.25, 0.5, 1 μg/mL가 되도록 처리하였고, BuOH, EtOAc, MC 분획물은 최종농도가 5, 25, 50, 100 μg/mL가 되도록 처리하여 2시간 배양하였다.
우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물을 이용하여 산화적 스트레스에 대한 항산화 및 신경세포 보호 효과를 측정해 보았다. DPPH는 비교적 안전한 radical을 가지는 물질로 항산화능이 있는 물질에게 전자를 내어주면서 고유의 자색이 탈색되는 원리로, 이 실험 방법은 비교적 안정적이고 간편하며 신뢰성이 높은 장점을 가지고 있어 항산화능 측정에 널리 이용되고 있다(Choi 등, 2003).
우산고로쇠를 음건하고 분쇄한 후 환류 냉각 장치가 부착된 추출 장치를 이용하여 MeOH로 3회 추출하여 MeOH 추출물을 조제하였다.
최종 농도가 5, 25, 50, 100 μg/mL가 되도록 ethanol에 녹인 각 농도 별 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 96-well plate에 혼합하여 실온에 30분간 방치시킨 후 540 nm에서 흡광도 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 군을 비교하여 free radical 소거 효과를 백분율(%)과 EC50 (DPPH radical을 50% 소거하는데 필요한 시료의 농도)로 나타내었다(Hatano 등, 1989).
최종 농도가 5, 25, 50, 100 μg/mL가 되도록 농도 별로 희석한 0.3 mL의 시료와 0.75 mL의 300 μM NBT, 936 μM NADH를 혼합한 후, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)를 첨가하였다.
추출 후 얻은 우산고로쇠 MeOH 추출물은 물에 현탁하여 극성별 유기용매인 n-BuOH (BuOH), ethyl acetate (EtOAc), methylene chloride (MC) 및 n-hexane (Hx)으로 다시 표준 분획물을 조제하였다.
탈아세틸화된 DCFH는 H2O2와 같은 ROS에 의해 산화되면서 강한 형광성을 가지는 DCF가 되는 원리를 이용하여 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물의 세포 내 ROS 억제 효과를 C6 glial cell을 이용하여 알아보았다.
대상 데이터
In vitro 라디칼 소거능 측정에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서, nitrotetrazolium blue chloride (NBT), nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), phenezine methosulfate (PMS)는 Bio Basic (Toronto, Canada)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 C6 glial cell은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며 배양을 위한 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)배지, fetalbovine serum (FBS)과 100 units/mL penicillin streptomycin, trypsin EDTA 용액은 Welgene(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
산화적 스트레스를 유도시키기 위해 사용한 Aβ25-35는 Sigma사에서 구입하였으며, 3차 멸균수를 이용하여 1 mM의 농도로 stock solution을 제조하여 37 oC incubator에서 72시간 배양 후, 실험에 사용하였다.
세포 생존율과 ROS 생성율 측정을 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO)와 2'7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)는 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였다.
실험 재료로 사용한 우산고로쇠(A. okamotoanum)는 국립수목원에서 제공받아 사용하였다. 우산고로쇠를 음건하고 분쇄한 후 환류 냉각 장치가 부착된 추출 장치를 이용하여 MeOH로 3회 추출하여 MeOH 추출물을 조제하였다.
총 페놀 및 플라보노이드 함량 측정에 사용한 phenol reagent, tannic acid, quercetin, sodium carbonate (Na2CO3), sodium nitrite (NaNO2), sodium hydroxide (NaOH)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)사에서 aluminium chloride (AlCl3)는 Tokyo Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
a-eMeans with the different letters are significantly different (p <0.05) by Duncan’s multiple range test.
대조군과 각 시료의 실험 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 각 실험 결과로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple test (p <0.05)를 이용하여 각 군의 평균 값들에 대한 유의성을 검정하였다.
이론/모형
O2− 소거능 실험은 Nishikimi 등의 방법(Nishikimi 등, 1972)으로 진행하였다.
총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteau 방법(Marinova 등, 2005)을 응용하여 측정하였다.
총 플라보노이드 함량은 Gorinstein 등의 방법(Gorinstein 등, 2007)을 응용하여 실험하였다.
성능/효과
MeOH 추출물은 101.29 mg/g extract, BuOH 분획물은 104.29 mg/g extract, EtOAc 분획물은 252.33 mg/g extract, MC 분획물은 96.20 mg/g extract 과 Hx 분획물은 8.75 mg/g extract 이 함유된 것으로 나타나 EtOAc 분획물이 플라보노이드의 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
60분을 기준으로 control군을 100%로 하였을 때 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물을 각 농도 별로 처리한 결과, 모든 군에서 control군에 비해 낮은 ROS 생성을 나타내었다.
Tannic acid equivalent 페놀 함량을 살펴본 결과, MeOH 추출물은 192.10 mg/g extract, BuOH 분획물은 182.12 mg/g extract, EtOAc 분획물은 532.63 mg/g extract, MC 분획물은 96.22 mg/g extract, Hx 분획물은 11.68 mg/g extract으로 나타나 우산고로쇠 MeOH 추출물과 분획물 중 EtOAc 분획물이 가장 높은 페놀 함량을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 1).
따라서 우산고로쇠의 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물은 Aβ25-35에 의해 유도된 ROS 생성을 억제시킴으로써 신경세포 보호 효과가 있는 것으로 나타났다.
따라서 Aβ25-35로 인한 독성과 산화적 스트레스에 대해 우산고로쇠가 우수한 보호 효과가 있는 것으로 나타났다(Table 3).
본 실험에서 O2−의 소거능을 측정한 결과, 모든 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물에서 O2− 소거능을 보였으며, 특히 EtOAc 분획물은 100 μg/mL 농도에서 80% 이상의 소거능을 나타내어 우산고로쇠 MeOH 추출물과 4가지 유기용매 추출 분획물 중 가장 높은 O2− 소거 효과를 가지는 것으로 확인하였다(Table 2).
본 실험에서 C6 glial cell에 Aβ25-35을 처리하여 산화적 스트레스를 통한 세포사멸을 유도한 결과, 정상군의 생존율을 100%로 보았을 때, Aβ25-35만을 처리한 control군은 51.11%로 산화적 스트레스에 의해 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 우산고로쇠 MeOH 추출물 및 4가지 유기용매 추출 분획물을 농도 별로 처리한 군에서는 control군에 비해 높은 세포 생존율을 나타내었다.
우산고로쇠 MeOH 추출물 및 4가지 유기용매 추출 분획물의 각 농도 별 DPPH 소거능을 살펴본 결과, MeOH 추출물 및 4가지 유기용매 추출 분획물은 우수한 DPPH 소거능을 나타내었으며 Hx 분획물을 제외한 나머지 MeOH 추출물과 분획물은 50 μg/mL에서 80% 이상의 DPPH radical 소거 효과를 보여 우산고로쇠의 DPPH 소거능이 매우 우수한 것을 확인 할 수 있었다(Table 1).
이러한 결과로부터 EtOAc 분획물이 in vitro에서 라디칼 소거능이 가장 우수한 것은 높은 페놀 및 플라보노이드 함량에 의한 것으로 사료된다.
특히 100 μg/mL의 MC와 BuOH 분획물 처리군에서 94.34와 100.11%의 세포 생존율을 나타내어 정상군과 유사한 생존율을 보였으며, EtOAc 분획물 처리군에서는 25 μg/mL 농도에서 98.51%의 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
특히 EtOAc 분획물은 5 μg/mL에서도 80% 이상의 높은 소거능을 보였으며 4.47 μg/mL의 EC50값을 나타내어 가장 우수한 DPPH 소거능을 가지는 것으로 나타났다.
특히 EtOAc 분획물 처리군의 100 μg/mL 농도에서는 66.75%로 normal군의 67.48%보다 낮은 생성율을 보임으로써 가장 높은 ROS 생성 저해능을 가지는 것을 확인할 수 있었다(Table 4).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소종의 종류에는 어떠한 것들이 있는가?
생명체는 체내 호흡과정을 통해 생명유지에 필요한 에너지를 얻으며 산소의 일부는 활성산소라는 유독 물질로 전환되어 체내 세포의 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Balaban 등, 2005). 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 종류로는 일중항산소(1O2), superoxide (O2−), hydroxyl radical (·OH)과 과산화수소(H2O2) 등이 있으며, 이들은 체내에서 물리적 또는 환경적 요소에 의해 끊임없이 생성되지만 대부분 체내 항산화 방어계에 의해 제거된다(Halliwell과 Gutteridge 1999; Valko 등, 2007). 하지만 ROS는 매우 불안정하고 반응성이 높아 과생성시 산화적 스트레스를 유발하여 체내 여러 물질과 반응하며 세포들을 공격하고 세포와 조직에 비가역적인 손상을 유도하거나 돌연변이, 세포 독성 및 발암 등을 초래하면서 당뇨병, 뇌 질환, 암, 심혈관계 질환 등의 원인 되는 것으로 알려져 있다(Fridovich 1989).
고로쇠나무란 무엇인가?
고로쇠나무(Acer mono)는 표고 100-1,800 m에 자생하는 단풍나무과에 속하는 낙엽교목으로 한국, 일본, 중국, 만주 등의 지역에 분포하고 있으며, 고로쇠나무 수액은 이뇨, 변비, 위장병, 통풍, 류마티스 관절염 등에 효험이 있다고 하여 오래 전부터 건강음료 및 민간약으로도 널리 사용되고 있다(Hashi와 Takeshita 1973). 고로쇠나무는 우리나라에서 총 9종의 품종과 변종이 생육하고 있으며, 그 중 우산고로쇠(Acer okamotoanum)는 울릉도에서만 자생하고 있는 고유수종으로 2002년 채취가 허용되면서 수액을 이용한 항산화, 항암, 면역 및 고혈압 개선 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Jeong 등, 2009; Yang 등, 2012; An 등, 2013).
활성산소종의 문제점은 무엇인가?
활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 종류로는 일중항산소(1O2), superoxide (O2−), hydroxyl radical (·OH)과 과산화수소(H2O2) 등이 있으며, 이들은 체내에서 물리적 또는 환경적 요소에 의해 끊임없이 생성되지만 대부분 체내 항산화 방어계에 의해 제거된다(Halliwell과 Gutteridge 1999; Valko 등, 2007). 하지만 ROS는 매우 불안정하고 반응성이 높아 과생성시 산화적 스트레스를 유발하여 체내 여러 물질과 반응하며 세포들을 공격하고 세포와 조직에 비가역적인 손상을 유도하거나 돌연변이, 세포 독성 및 발암 등을 초래하면서 당뇨병, 뇌 질환, 암, 심혈관계 질환 등의 원인 되는 것으로 알려져 있다(Fridovich 1989). 특히 뇌 신경세포는 다른 장기들에 비해 대사를 위한 산소 이용률이 높으나 활성산소에 대한 항산화 효소가 소량 존재하여 신경세포는 ROS에 의한 손상을 쉽게 받으면서 Alzheimer’s disease (AD)와 같은 신경퇴행성질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Reynolds 등, 2007; Knott 등, 2008). 따라서, 활성산소에 의한 산화적 스트레스가 위험인자로 작용하는 많은 만성퇴행성 질환의 예방 및 치료를 위해, 독성과 부작용이 적은 천연물에서 ROS 제거를 위한 항산화 물질을 찾고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다(Choi 등, 2003; Muthaiyah 등, 2011).
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