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문제 정의
- 그러나 rosmarinic acid의 항산화에 대한 연구는 그리 많이 되어 있지 않다. 본 연구는 치매에 대한 rosmarinic acid의 영향을 조사하기 위하여 배양 대뇌의 신경교종세포를 재료로 치매유발제인 염화알루미늄(AlCl3)의 독성과 이에 대한 rosmarinicacid의 영향을 산화적 손상 측면에서 조사하였다.
- 더욱이 rosmarinic acid는 천연성분으로서 기존의 화학치료제에 비하여 안전하여 부작용이 없으며 또한 효능이 뛰어나다는 장점이 있다[12]. 따라서, 본 연구에서는 rosemarinic acid의 항산화능에 대하여 알아 보았다.
- 이상의 결과로부터 산화적 손상이 AlCl3의 독성에 관여하고 있으며, rosmarinicacid는 항산화능에 의하여 AlCl3의 독성을 효과적으로 방어하였다. 따라서, rosmarinic acid와 같은 천연성분은 치매와 같이 산화적 손상과 관련된 병변의 치료적 개선을 위한 천연 소재로서의 가능성을 제시하였다.
제안 방법
- Rosmarinic acid의 제조는 에탄올이나 working solution에 녹여 각각 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 100 μM의 저장액을 만들어 사용하였으며, XTT는 PBS를 사용하여 50 mg/mL 농도의 저장액을 만든 후 냉암소에 넣어 보관 후 실험 당일 필요량을 직접 배양액에 첨가하여 사용하였다.
- AlCl3에 대한 vitamin E의 영향을 조사하기 위하여 배양 C6glioma 세포에 AlCl3를 처리하기 2시간 전에 대한 vitamin E가 10 μM과 30 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 배양한 다음 세포생존율에 의하여 AlCl3의 처리와 비교 조사하였다.
- AlCl3가 배양 C6 glioma 세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여 AlCl3가 각각 120∼160 μM 농도로 포함된 배양액에서 세포를 배양한 다음 세포생존율에 의하여 대조군과 비교 조사하였다.
- Vitamin E의 항산화능 조사를 위하여 배양중인 C6 glioma 세포에 20 μM H2O2를 처리하기 2시간 전에 vitamin E가 각각 10 μM과 30 μM로 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 후 세포생존율에 의하여 대조군과 비교 조사하였다.
- AlCl3에 대한 rosmarinic acid의 영향을 알아보기 위하여 AlCl3를 배양 세포에 처리하기 2시간 전에 rosmarinic acid가 각각 20 μM과 40 μM로 포함된 배양액에 처리한 후 세포생존율에 의하여 이의 영향을 조사하였다.
- Borenfreund와 Puerner [15]의 방법에 따라, C6 glioma 세포에 여러 농도의 약제를 처리한 다음 실험전에 제조한 XTT 50mg/mL를 배양용기 당 10 μL씩을 넣은 후 4시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 DMSO를 넣은 다음 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다.
- 처리 완료 후 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료첨가군과 시료무첨가군간의 차이를 백분율로 나타냈으며, 또한 vitamin E의 활성을 양성대조군으로 하여 비교 조사하였다.
- 처리 완료 후 HCl로 반응시킨 다음 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, vitamin E를 양성대조군으로 하여 비교 조사하였으며, SOD유사활성은 시료첨가군과 무첨가군의 차이에 의한 백분율로 표시하였다.
- 치매유발제인 AlCl3에 대한 rosmarinic acid의 영향을 알아보기 위하여 뇌세포종인 배양 C6 glioma 세포를 배양한 후 세포 생존율을 비롯한 전자공여능(electron donating ability, EDA),SOD-유사활성(superoxide dismutase-like activity) 및 지질 과산화(lipid peroxidation) 억제능을 조사하였다. 본 연구에서 AlCl3는 배양 세포에 농도 의존적으로 세포생존율을 대조군에 비하여 유의하게 감소시킴으로서 세포독성을 나타냈다.
대상 데이터
- C6 glioma 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Maryland, USA)에서 분양 받아 사용하였다.
- 반응이 완료된 후 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 증류수를 대조군으로 사용하였으며 양성대조군으로는 vitamin E를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 rosmarinic acid를 비롯한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), pyrogallol, ethyl alcohol,Tris-HCl buffer (pH 8.5), linoleic acid, phosphate buffered saline (PBS), trypsin, ammonium thiocyanate, dimethylsulfoxide (DMSO), vitamin E 및 2, 3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-caboxanilide,disodium salt (XTT)는 Sigma사(Sigma Chemical, Saint Louis,MO, USA)에서 구입하였다. Rosmarinic acid의 제조는 에탄올이나 working solution에 녹여 각각 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 100 μM의 저장액을 만들어 사용하였으며, XTT는 PBS를 사용하여 50 mg/mL 농도의 저장액을 만든 후 냉암소에 넣어 보관 후 실험 당일 필요량을 직접 배양액에 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 분석은 SPSS version 12 (SPSS, Chicago,IL, USA)에 의하였고 mean±SD로 표시하였다. 자료에 의한 유의성 검정은 일변량분산분석 (ANOVA)에 의하였으며 p-value가 0.05 미만의 경우를 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- 세포의 배양은 Park 등[14]의 방법에 따라, 0.025% trypsin을 사용하여 부착세포를 분리한 후 10% 혈청이 함유된 MEM 배양액에 넣어 균질화 한 다음 세포수가 1×105/well이 되도록 산정하여 배양용기에 심었다.
- 지질과산화는 Kikuzaki&Nakatani [18]의 방법에 따라, 시료 3.9 mL를 에탄올과 혼합하고 에탄올에 녹인 2.52% linoleicacid와 0.05 M PBS (pH 7.0)용액 12.1 mL를 첨가하여 40°C에서 24시간 동안 배양하였다.
- SOD-유사활성 측정은 Marklund & Marklund [17]의 방법에 따라, 시료에 Tris-HCl buffer와 10 mM pyrogallol을 가하고 25°C에서 10분 동안 처리하였다.
- 전자공여능의 측정은 Blois [16]의 방법에 따라, 메탄올 시료에 0.3 mM DPPH 메탄올용액 100 μL를 첨가하여 30분간 처리하였다.
- Borenfreund와 Puerner [15]의 방법에 따라, C6 glioma 세포에 여러 농도의 약제를 처리한 다음 실험전에 제조한 XTT 50mg/mL를 배양용기 당 10 μL씩을 넣은 후 4시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- Vitamin E의 항산화능을 알아보기 위하여 10 μM과 30 μM의 vitamin E를 각각 처리한 결과 20 μM의 H2O2 단독 처리에서는 세포생존율이 대조군인 100% (0.362±0.02)에 비하여 41.7% (0.151±0.01)로 나타났다.
- 본 실험에서 AlCl3의 XTT50 값이 142.2 μM로 나타남으로서 Borenfreund와 Puerner [15]의 독성판정기준에 따라 중간독성인 것으로 나타났다.
- AlCl3의 세포독성 조사를 위하여 AlCl3가 120∼160 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 결과 처리농도에 의존적으로 세포생존율을 유의하게 감소시켰으며, XTT50값은142.2 μM 에서 나타났다(Table 1).
- AlCl3의 독성에 대한 vitamin E의 영향을 조사하기 위하여 배양 세포에 XTT50값의 AlCl3를 처리하기 2시간 전에 10 μM과 30 μM의 vitamin E를 각각 처리한 결과 AlCl3 단독 처리에서는 세포생존율이 대조군인 100% (0.297±0.02)에 비하여 36.4%(0.108±0.01)로 나타난 데 비하여 10 μM vitamin E의 처리에서는 72.4% (0.215±0.01)로 나타나 이는 H2O2 단독 처리에 비하여 유의하게 증가하였다(p＜0.001).
- 특히 40 μM 농도에서 rosmarinic acid의 전자공여능은 양성대조군으로 사용한 10 μM vitamin E의 활성값인 77.1% (p＜0.001)값의 50% 이상인 것으로 나타났다(Table 5).
- Rosmarinic acid에 대한 전자공여능을 측정하기 위하여 각각 20 μM과 40 μM 농도의 rosmarinic acid 시료를 분석한 결과 20 μM 처리에서는 전자공여능은 21.3% (p＜0.01)로 나타났으며, 40 μM 처리에서는 39.5% (p＜0.001)로 나타나 이는 모두 대조군에 비하여 유의한 증가를 보였다.
- AlCl3에 대한 rosmarinic acid의 영향을 알아 보기 위하여 rosmarinic acid를 각각 20 μM과 40 μM의 농도로 세포에 처리한 결과 20 μM의 처리에서는 세포생존율이 51.8%로 나타나 AlCl3 단독 처리에 비하여 다소 증가한 것으로 나타났다.
- 또한, 30 μM의 처리에서는 세포생존율이 83.5% (0.248±0.02)로 나타남으로써 이 역시 AlCl3 단독 처리에 비하여 유의한 증가를 보였다(p＜0.001)(Table 3).
- 001) (Table 2). 본 실험 결과는 vitamin E가 처리 농도에 비례하여 항산화능의 증가를 보여주었으며, 특히 10 uM 농도에서는 80% 이상의 높은 항산화능을 나타냈다(Table 2).
- Rosmarinic acid 시료에 대한 SOD-유사활성 측정에 있어서 20 μM 농도처리에서는 SOD-유사활성은 대조군에 비하여 116.4% (p＜0.05)로 나타났으며, 40 μM 농도처리에서는 130.3% (p＜0.001)로 나타나 이는 모두 대조군에 비하여 유의하게 증가한 것으로 나타났다.
- 한편, vitamin E의 항산화능 조사에 있어서, 자유라디칼의 일종인 과산화수소(H2O2)에 대한 vitamin E의 처리에서 vitaminE는 처리한 농도에 비례하여 H2O2로 손상된 세포생존율을 유의하게 증가시켰으며(p＜0.001), 특히 10 μM 농도처리에서는 80% 이상의 높은 항산화능을 나타냈다(Table 2).
- Rosmarinic acid에 대한 지질과산화의 조사에 있어서 20 μM 농도의 rosmarinic acid 처리에서는 지질과산화가 대조군에 비하여 75.7%로 나타났으며, 40 μM 농도처리에서는 58.4%로 나타나 모두 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타냈다.
- 4%로 나타나 모두 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타냈다. 따라서,지질과산화 억제능은 각각 24.3% (p＜0.01)와 41.6% (p＜0.001)로 모두 유의하게 증가하였다. 특히, 40 μM 농도처리에서는 양성대조군인 vitamin E의 활성값인 62.
- 본 실험에서 AlCl3의 독성에 대한 vitamin E의 영향을 조사한 결과 vitamin E는 AlCl3의 독성을 유효하게 방어한 것으로 나타남으로써 AlCl3의 독성이 산화적 손상과 관련이 있다는 것을 알 수 있었다. 알루미늄은 쉽게 혈액-뇌관문(blood-brain barrier,BBB)을 통과하여 뇌세포에 손상을 주게 되는데 이 경우 세포손상이 산화적 손상에 의한 경우 AlCl3가 수은이나 크롬과 같이 자유라디칼을 생성하여 세포에 직접 영향을 주었거나[25], 또는 항산화계에 속하는 항산화 효소의 기능저해나 전자전달계에 손상을 초래함으로써 세포사멸을 유도하였을 가능성이 클 것으로 생각된다.
- 먼저 전자공유능에 대한 조사에서 20 μM과 40 μM의 rosmarinic acid 처리에서 대조군에 비하여 공유능이 유의하게 높게 나타남으로서 rosmarinic acid가 자유라디칼 제거능의 효과가 있음을 말해 주고 있다.
- 한편, rosmarinic acid가 AlCl3에 미치는 영향에 있어서, 40 μM rosmarinic acid 처리에서는 AlCl3만의 처리에 비하여 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로서 AlCl3의 산화적 손상으로부터 세포손상을 보호하였다.
- 지질과산화 억제능의 분석에 있어서 20 μM과 40 μM rosmarinic acid 처리에서 모두 지질과산화의 높은 억제능을 보였다(p＜0.001).
- 001). 본 실험결과는 rosmarinic acid가 SOD와 유사한 자유라디칼 제거를 위한 효소활성이 있음을 말해주고 있으며, 이 같은 항산화 활성은 본 실험에서 행한 전자공여능의 분석과도 일치함을 알 수 있었다. 인체의 항산화계에서는 대사과정 중에 생성된 hydroxyl anion radical (∙OH−1)이나 superoxide anion radical (∙O−2)과 같은 자유라디칼을 SOD를 비롯한 catalase나 glutathione peroxidase (GSHpx)와 같은 항산화 효소들이 물로 변환시켜줌으로서 인체에는 아무런 영향을 미치지 않게 된다[29].
- 001). 본 실험 결과는 rosmarinic acid가 막의 지질과산화를 억제함으로서 세포손상을 방어하였음을 말해주고 있으며[30], 이는 본 실험의 전자공여능 분석이나 SOD-유사활성의 분석 결과와도 일치함을 알 수 있었다. 지질과산화분석은 산화적 손상에 의하여 막을 구성하고 있는 인지질 등을 산화시킴으로서 나타나는 막손상 정도를 측정하는 정량분석 방법의 하나이다.
- 에 대한 rosmarinic acid의 영향을 알아보기 위하여 뇌세포종인 배양 C6 glioma 세포를 배양한 후 세포 생존율을 비롯한 전자공여능(electron donating ability, EDA),SOD-유사활성(superoxide dismutase-like activity) 및 지질 과산화(lipid peroxidation) 억제능을 조사하였다. 본 연구에서 AlCl3는 배양 세포에 농도 의존적으로 세포생존율을 대조군에 비하여 유의하게 감소시킴으로서 세포독성을 나타냈다. 또한,AlCl3의 XTT50값이 142.
- 한편, rosmarinic acid가 AlCl3에 미치는 영향에 있어서, 40 μM rosmarinic acid 처리에서는 AlCl3만의 처리에 비하여 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로서 AlCl3의 산화적 손상으로부터 세포손상을 보호하였다. 또한 rosmarinicacid는 전자공여능을 비롯한 SOD-유사활성 및 지질과산화의 억제효과를 보임으로서 항산화능을 나타냈다. 이상의 결과로부터 산화적 손상이 AlCl3의 독성에 관여하고 있으며, rosmarinicacid는 항산화능에 의하여 AlCl3의 독성을 효과적으로 방어하였다.
- 또한 rosmarinicacid는 전자공여능을 비롯한 SOD-유사활성 및 지질과산화의 억제효과를 보임으로서 항산화능을 나타냈다. 이상의 결과로부터 산화적 손상이 AlCl3의 독성에 관여하고 있으며, rosmarinicacid는 항산화능에 의하여 AlCl3의 독성을 효과적으로 방어하였다. 따라서, rosmarinic acid와 같은 천연성분은 치매와 같이 산화적 손상과 관련된 병변의 치료적 개선을 위한 천연 소재로서의 가능성을 제시하였다.
후속연구
- 지질과산화분석은 산화적 손상에 의하여 막을 구성하고 있는 인지질 등을 산화시킴으로서 나타나는 막손상 정도를 측정하는 정량분석 방법의 하나이다. 그러나 rosmarinic acid와 같은 천연물질에 대한 성분활성을 항산화 측면에서 규명하기 위하여서는 세포내 항산화계와 관련된 신호전달계나 또는 산화적 손상으로 인한 세포고사와 관련이 깊은 수용체와 같은 측면에서 지속적으로 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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