본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재 개발을 위해 복분자 씨앗의 구성성분인 casuarictin을 이용하여 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인 하고자 하였다. Casuarictin의 항노화 효과를 CCD-986sk 세포를 이용하여 측정한 결과, casuarictin은 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 억제하였으며, pro-collagen의 발현을 증가시키고 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 노화 인자인 활성산소종의 생성 억제와 주름과 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 합성 및 분해억제를 통해 항산화 및 주름개선 효과가 있는 것으로 판단되며, 따라서 casuarictin은 화장품 분야에서 항노화 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재 개발을 위해 복분자 씨앗의 구성성분인 casuarictin을 이용하여 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인 하고자 하였다. Casuarictin의 항노화 효과를 CCD-986sk 세포를 이용하여 측정한 결과, casuarictin은 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 억제하였으며, pro-collagen의 발현을 증가시키고 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 노화 인자인 활성산소종의 생성 억제와 주름과 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 합성 및 분해억제를 통해 항산화 및 주름개선 효과가 있는 것으로 판단되며, 따라서 casuarictin은 화장품 분야에서 항노화 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 사료된다.
To develop a new functional agent for cosmetics, we investigated the anti-aging activities in fibroblasts of casuarictin. The anti-aging effect of casuarictin in CCD-986sk cell was as follows: it inhibited ROS expression increased by Ultraviolet B and suppressed pro-collagen expression. Also, casuar...
To develop a new functional agent for cosmetics, we investigated the anti-aging activities in fibroblasts of casuarictin. The anti-aging effect of casuarictin in CCD-986sk cell was as follows: it inhibited ROS expression increased by Ultraviolet B and suppressed pro-collagen expression. Also, casuarictin had inhibited Matrix metalloproteinase-1 expression. Therefore, the results suggested that casuarictin has considerable potential as a cosmetics ingredient with a anti-aging effect.
To develop a new functional agent for cosmetics, we investigated the anti-aging activities in fibroblasts of casuarictin. The anti-aging effect of casuarictin in CCD-986sk cell was as follows: it inhibited ROS expression increased by Ultraviolet B and suppressed pro-collagen expression. Also, casuarictin had inhibited Matrix metalloproteinase-1 expression. Therefore, the results suggested that casuarictin has considerable potential as a cosmetics ingredient with a anti-aging effect.
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문제 정의
지금까지 ellagitannin계 물질에 대한 다양한 효능에 대해 연구가 진행되었으나 casuarictin에 대한 개별연구는 부족한 실정이며 특히 항암, 항염, 항산화 이외의 효능에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있는 실정이다. 따라서, 본 실험에서는 복분자 씨앗 추출물로부터 분리된 casuarictin을 이용하여 기존에 밝혀지지 않은 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로의 이용 가능성을 확인하고자 하였다.
본 실험에서 CCD-986sk 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정하기 위해 세포독성측정(MTT assay)을 진행하였다. 배양된 CCD-986sk 세포를 48 well plate에 각각 5×104 cell/wells로 접종하고 24시간 배양하였다.
본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재 개발을 위해 복분자 씨앗의 구성성분인 casuarictin을 이용하여 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인 하고자 하였다. Casuarictin의 항노화 효과를 CCD-986sk 세포를 이용하여 측정한 결과, casuarictin은 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 억제하였으며, pro-collagen의 발현을 증가시키고 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
제안 방법
5 % skim milk가 함유된 tris 완충용액으로 1시간 blocking 한 후, Pro-collagen, MMP-1, β-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다.
동일 배지로 교체한 후 UVB(20 mJ/cm2)을 조사 한 뒤, casuarictin을 5, 10, 25 μg/mL 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다. Blank와 control group은 sample의 처리 없이 배양하였으며 그 후 각 well의 상등액을 이용하여 procollagen type C-peptide assay kit와 MMP-1 hunam ELISA kit을 사용하여 실험을 진행한 뒤, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA를 통해 Pro-collagen의 합성능과 MMP-1의 발현 저해를 정량적으로 확인하였으며, CCD-986sk 세포에서 단백질을 추출하여 protein level에서의 casuarictin의 효과를 확인하기 위하여 western blot을 실행하였다. UVB를 조사한 그룹에서는 pro-collagen 발현이 UVB를 조사하지 않은 그룹에 비해 40 % 이상 발현이 저해되었으며, MMP-1의 발현은 UVB 조사한 그룹이 조사하지 않은 그룹에 비해 2배 이상 발현률이 증가하였다.
따라서 pro-peptide의 양을 측정함으로써 세포내에서의 collagen의 합성 정도를 파악할 수 있다(Parfitt 등, 1987). Pro-collagen의 합성을 촉진 시킬 수 있는 소재는 탄력 있는 피부를 만들어 주는 화장품 원료로서 사용 가능성이 높다고 생각되며 이에 casuarictin을 이용하여 procollagen 합성 실험을 수행하였다. 그 결과, casuarictin은 농도의존적으로 pro-collagen 생성을 증가시켰으며, 특히 최고 농도인 25 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 20 % 이상의 높은 생성률을 나타내었다.
동일 배지로 교체한 후 UVB (20 mJ/cm2)을 조사한 뒤, casuarictin을 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Clo H2O2 assay를 수행하였다.
동일 배지로 교체한 후 UVB (20 mJ/cm2)을 조사한 뒤, casuarictin을 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다.
동일 배지로 교체한 후 UVB(20 mJ/cm2)을 조사 한 뒤, casuarictin을 5, 10, 25 μg/mL 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다.
동일 배지로 교체한 후 casuarictin을 농도별(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)로 희석하여 처리한 후 48시간 CO2 incubator에서 배양하였다.
그 결과, casuarictin은 농도의존적으로 pro-collagen 생성을 증가시켰으며, 특히 최고 농도인 25 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 20 % 이상의 높은 생성률을 나타내었다. 또한 MMP-1은 type collagen을 분해하는 인자로 알려져 있으므로(Talwar 등, 1995; Nagase와 Woessner 1999) 이 인자의 발현을 저해하는 것이 피부의 탄력유지에 효과를 줄 수 있을 것으로 예측되는 바 casuarictin의 MMP-1의 발현 저해율 측정 실험을 수행하였다. 그 결과, UVB로 발현된 MMP-1을 control과 비교하였을 때 casuarictin이 5, 10, 25 μg/mL의 농도에서 각각 14, 15, 22%의 발현을 저해하는 것을 확인하였다(Fig.
대상 데이터
American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구매한 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 10 % FBS, 5 % antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 배양기에서 37oC, 5 % CO2 조건으로 배양하였다.
유효성 평가를 위한 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1A1, β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 Abcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 microplate reader 장비는 Spectrostar Nano (BGM LabTech, Ortenberg, Germany)를 사용하였으며, Chemi-Doc은 LAS4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
세포 독성 실험 및 배양을 위한 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (StLouis, MO, USA) 의 제품을 사용하였으며 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 Antibiotic-Antimyotic (100X)는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.
유효성 평가를 위한 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1A1, β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 Abcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
0을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 t 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95 % 수준(*p < 0.
이론/모형
Casuarictin의 세포 독성측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 수행하였다. CCD-986sk 세포에 casuarictin을 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과, 25 μg/mL 이하의 농도에서 세포생존율이 90 % 이상으로 나타내어 CCD-986sk 세포의 생존율에 큰 영향을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig.
성능/효과
CCD-986sk 세포에 casuarictin을 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과, 25 μg/mL 이하의 농도에서 세포생존율이 90 % 이상으로 나타내어 CCD-986sk 세포의 생존율에 큰 영향을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig. 1).
피부에 UVB의 노출은 활성산소종 생성을 야기시키며(Fisher 등, 1997; Yoon 등, 2003; Han 등, 2013), 이때 생성되는 ROS는 피부세포 내에서의 신호전달 과정화에 영향을 미쳐 피부 주름과 관련된 전사인자들을 활성화시킨다(Pentland 등, 1995; Park등, 2010). CCD-986sk 세포에서의 UVB 조사에 따른 ROS 생성을 측정한 결과, UVB로 유도된 그룹에서는 정상군에 비해 2배 가까이 ROS 생성률이 증가하였으며, casuarictin을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적으로 ROS 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(Fig. 2).
본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재 개발을 위해 복분자 씨앗의 구성성분인 casuarictin을 이용하여 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인 하고자 하였다. Casuarictin의 항노화 효과를 CCD-986sk 세포를 이용하여 측정한 결과, casuarictin은 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 억제하였으며, pro-collagen의 발현을 증가시키고 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 노화 인자인 활성산소종의 생성 억제와 주름과 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 합성 및 분해억제를 통해 항산화 및 주름 개선 효과가 있는 것으로 판단되며, 따라서 casuarictin은 화장품 분야에서 항노화 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 사료된다.
ELISA를 통해 Pro-collagen의 합성능과 MMP-1의 발현 저해를 정량적으로 확인하였으며, CCD-986sk 세포에서 단백질을 추출하여 protein level에서의 casuarictin의 효과를 확인하기 위하여 western blot을 실행하였다. UVB를 조사한 그룹에서는 pro-collagen 발현이 UVB를 조사하지 않은 그룹에 비해 40 % 이상 발현이 저해되었으며, MMP-1의 발현은 UVB 조사한 그룹이 조사하지 않은 그룹에 비해 2배 이상 발현률이 증가하였다. 여기에 casuarictin을 농도별로 처리한 결과 pro-collagen protein 발현에서 대조군에 비해 20 % 이상 생성량이 증가하였으며, MMP-1 protein 발현이 최고 농도인 25 μg/mL에서 57%의 저해률을 나타내어 casuarictin의 높은 저해능을 확인하였다(Fig.
그 결과, UVB로 발현된 MMP-1을 control과 비교하였을 때 casuarictin이 5, 10, 25 μg/mL의 농도에서 각각 14, 15, 22%의 발현을 저해하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
그 결과, casuarictin은 농도의존적으로 pro-collagen 생성을 증가시켰으며, 특히 최고 농도인 25 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 20 % 이상의 높은 생성률을 나타내었다.
4). 따라서 casuarictin은 CCD-986sk 세포 내에서 ROS와 같은 노화 인자의 생성을 억제함과 동시에 피부의 주요 구성성분인 collagen의 합성 및 분해억제 효능을 나타냄으로써 항노화 소재로서의 활용가치가 있는 것으로 판단된다.
여기에 casuarictin을 농도별로 처리한 결과 pro-collagen protein 발현에서 대조군에 비해 20 % 이상 생성량이 증가하였으며, MMP-1 protein 발현이 최고 농도인 25 μg/mL에서 57%의 저해률을 나타내어 casuarictin의 높은 저해능을 확인하였다(Fig. 4).
후속연구
Casuarictin의 항노화 효과를 CCD-986sk 세포를 이용하여 측정한 결과, casuarictin은 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 억제하였으며, pro-collagen의 발현을 증가시키고 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 노화 인자인 활성산소종의 생성 억제와 주름과 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 합성 및 분해억제를 통해 항산화 및 주름 개선 효과가 있는 것으로 판단되며, 따라서 casuarictin은 화장품 분야에서 항노화 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부노화는 어떻게 구분되는가?
피부노화는 잔주름, 피부건조증, 탄력감소 등의 경미한 임상 특징을 나타내는 내인성 노화와 굵고 깊은 주름이 발생하며 잔주름도 많이 발생하는 광노화로 나눌 수 있다(Jean 1995; Laure와 Fisher 2002).
collagen이란 무엇인가?
세포외기질(extracellular martix)의 주요 구성성분인 collagen은 섬유아세포에 의해 합성되며, 피부의 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착, 세포 분할과 분화유도 등의 역할을 한다(Jeroma 등, 1998). 피부에 높은 농도로 존재하는 collagen은 트립신과 같은 단백질 분해효소의 작용은 받지 않으나 collagenase에 의해 분해된다(Grant와 Alburn 1959; Demina와 Lysenko 1996).
Ultraviolet B가 생성하는 활성산소종은 피부에 어떠한 영향을 미치는가?
또한, 활성산소종은 MMPs의 활성을 증가시켜 결합조직성분의 분해, 절단 및 비정상적인 교차결합에 의하여 주름을 생성시킨다(Afaq 등, 2007; Park과 Lee 2008). 즉 자외선에 의한 활성산소종은 피부 세포 내 여러 가지 신호 전달체계를 활성화시킴으로써 MMPs의 증가를 가져오며 이는 collagen의 생성과 탄력섬유의 합성을 감소시켜 주름을 생성하게 되는 피부노화의 주된 원인임을 알 수 있다(Berneburg등 2000).
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