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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 《東醫寶鑑》에 기재된 烏鷄의 효능에 착안하여 MIA로 골관절염을 유발하기 2주전부터 골관절염 유발 후 4주 동안 경구 투여함으로써 관절염에 대한 예방과 치료에 대한 효능을 혈청 내 관절염 유관 인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 조직병리학적 검사 등을 통해 확인한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 본 저자는 문헌적 근거와 함께 이전 실험적 연구결과13,14)를 통해 밝혀진 항산화, 항염증 및 선천면역 반응 억제에 대한 유의적인 결과에 착안하여 노화와 염증에 의해 발병되는 대표적 질환인 골관절염에 대해 활용성을 제고하고자 하였다. 이에 따라 랫드 동물모델에게 관절염을 유발하기 2주 전부터 MIA로 관절염을 유발한 후 4주 동안 경구 투여 독성 한계 용량인 2,000 ㎎/㎏을 최고 농도로 설정하여 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏ 등 3개의 농도로 연산 오계를 각각 경구 투여하고 골관절염 유관 인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 조직병리 검사를 진행하여 골관절염에 대한 예방 및 치료제로써의 효능을 확인하였다.
- 본 연구에서는 연산오계 (YO)의 골관절염에 대한 예방 및 치료 효능을 객관적으로 검증하기 위하여 골관절염을 유발하기 2주전부터 MIA로 관절염을 유발 후 4주동안 YO를 500, 1000, 2000 (㎎/㎏/day) 용량을 투여한 후 혈액 내 관절염 유관인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 병리조직검사 등을 다각도로 확인한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 2주간의 경구 투여 이후 마취제 (케타민 0.4 ㎖ + 림푼 0.1 ㎖)로 Rat를 마취하여 오른쪽 무릎관절 주변을 깨끗이 제모한 후, 골관절염 유발물질인 MIA를 당뇨주사기 (BD Ultra-Fine Ⅱ Insulin Syringe : BD, U.S.A.)를 사용하여 우측 무릎 관절강 내에 60 ㎎/㎖의 농도로 50 ㎕씩 투여하였고 MIA 희석시에는 생리식염수 (0.9% saline)를 사용하였다.
- 실험군은 관절염을 유발하지 않은 정상군 (이하, Normal)과 관절염 유발 후 증류수만을 경구 투여한 음성대조군 (이하, Control) 및 관절염 유발 2주전부터 YO를 500 ㎎/㎏/day(이하, 500), 1,000 ㎎/㎏/day (이하, 1000), 2,000 ㎎/㎏/day (이하, 2000)로 경구 투여 한 3개의 실험군 등 총 6개 그룹으로 나누었다. 정상군 6마리를 제외한 나머지 그룹은 각각 10마리씩 분류하고 MIA로 관절염을 유도한 이후 유발되지 않은 동물과 그룹 당 필요한 마릿수인 6마리를 초과한 경우는 동물윤리준칙에 맞추어 안락사를 진행하여 최종적으로 그룹 당 6마리로 실험을 진행하였다.
- 실험군은 관절염을 유발하지 않은 정상군 (이하, Normal)과 관절염 유발 후 증류수만을 경구 투여한 음성대조군 (이하, Control) 및 관절염 유발 2주전부터 YO를 500 ㎎/㎏/day(이하, 500), 1,000 ㎎/㎏/day (이하, 1000), 2,000 ㎎/㎏/day (이하, 2000)로 경구 투여 한 3개의 실험군 등 총 6개 그룹으로 나누었다. 정상군 6마리를 제외한 나머지 그룹은 각각 10마리씩 분류하고 MIA로 관절염을 유도한 이후 유발되지 않은 동물과 그룹 당 필요한 마릿수인 6마리를 초과한 경우는 동물윤리준칙에 맞추어 안락사를 진행하여 최종적으로 그룹 당 6마리로 실험을 진행하였다.
- Micro-CT가 종료된 조직을 케이피앤티 (Korea)에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다.
- 실험 종료 직전 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였으며, 기기 설치된 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 각 뒷발에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균 산출하였다. 산출 된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발에 분포된 체중의 백분율을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
- 실험 종료 직전 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였으며, 기기 설치된 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 각 뒷발에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균 산출하였다. 산출 된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발에 분포된 체중의 백분율을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
- 실험종료 후 우측 무릎 부위를 적출하여 포르말린에 고정한 뒤 동국대학교 (Korea) 측에 의뢰하여 정면과 측면의 촬영 결과를 3D로 변환하여 연골 부위를 판독하였다.
- Micro-CT가 종료된 조직을 케이피앤티 (Korea)에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다. 이후 염색된 조직을 광학현미경으로 관찰하여 조직병리 검사를 진행하였다.
- 를 통해 밝혀진 항산화, 항염증 및 선천면역 반응 억제에 대한 유의적인 결과에 착안하여 노화와 염증에 의해 발병되는 대표적 질환인 골관절염에 대해 활용성을 제고하고자 하였다. 이에 따라 랫드 동물모델에게 관절염을 유발하기 2주 전부터 MIA로 관절염을 유발한 후 4주 동안 경구 투여 독성 한계 용량인 2,000 ㎎/㎏을 최고 농도로 설정하여 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏ 등 3개의 농도로 연산 오계를 각각 경구 투여하고 골관절염 유관 인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 조직병리 검사를 진행하여 골관절염에 대한 예방 및 치료제로써의 효능을 확인하였다.
- 연산오계 투여가 골관절염을 악화시키는 요인을 감소시킴에 따라 골 형성에 도움을 주는 골 대사 지표들을 확인하고자 calcitonin과 glycosaminoglycan 등의 생성량을 확인하였다. Calcitonin은 칼슘의 손실을 예방하고 치료하는 호르몬으로써 갑상선에서 분비되어 혈중 칼슘을 뼈로 유입하는 작용을 하며, glycosaminoglycan은 관절 연골의 주요 성분인 proteoglycan을 형성하고 관절연골에 탄력성을 제공한다19, 20).
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 烏鷄는 《東醫寶鑑 湯液編》에 烏雄鷄肉이라 하여 “性微溫, 無毒.
- 수컷 6주령의 SD-Rat (170-200 g)을 ㈜라온바이오(Korea)사에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 일반 고형 사료를 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 연구에 사용된 시약은 ether (Sigma Co., U.S.A.), formaldehyde (Sigma Co., U.S.A.), Rat total MMP-9 quantikine kit (R&D system, U.S.A.), Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP) ELISA kit, Rat calcitonin ELISA kit, Rat Cross-Linked C-Terminal Telopeptides of Type Ⅱ Collagen (CTX-Ⅱ) ELISA kit, Rat Glycosaminoglycans (GAGs) ELISA kit (MyBioSouce Co., CA), MIA : Monosodium iodoacetate (Sigma Co., U.S.A.) 등을 사용하였으며, 기기는 ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.) Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 연산오계 (Yeonsan Ogye, 이하, YO로 표기)는 지산농원 (Korea)에서 구입 하였고, 분리한 육질 1 ㎏에 물 10 L를 넣어 3시간 동안 환류 추출하였다. 이후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 얻은 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 109.
데이터처리
- The statistical significance of differences between normal and control groups (+++ : p <0.001) or control and YO groups(*** : p <0.001, ** : p <0.01) based on ANOVA with student's t -test determined.
- 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다 (p <0.001, p <0.01, p <0.05).
- 본 연구의 실험 결과는 평균값±표준 편차 (mean ± S.D.) 로 표시하였다.
- 다시 washing 작업 후 100 ㎕의 substrate solution 용액을 첨가한 후 30분 동안 37℃ incubator에서 빛을 차단한 채 반응시키고 100 ㎕의 stop solution을 넣어 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였다. 측정결과는 4 parameter logistic curve-fit을 이용하여 계산된 값을 대조군을 기준으로 백분율로 계산하였다.
- 이후, washing 작업을 실행한 후 50 ㎕의 chromogen solution A와 B를 순차적으로 넣고 15분 동안 incubator에서 반응시키고 50 ㎕의 stop solution을 넣고 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였다. 측정결과는 log-log fit을 이용하여 계산된 값을 대조군을 기준으로 백분율로 계산하였다.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (++ : p <0.01) or control and YO groups (** : p <0.01, *** : p <0.001) based on ANOVA with student's t -test determined.
- The statistical significance of differences between control and YO groups (** : p <0.01) based on ANOVA with student's t -test determined.
- The statistical significance of differences between control and YO groups (*** : p <0.001) based on ANOVA with student's t -test determined.
- The statistical significance of differences between control and YO groups (** : p <0.01, *** : p <0.001) based on ANOVA with student's t -test determined.
성능/효과
- 실험 종료 후 혈청 내 MMP-9 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 MMP-9 생성량이 증가하였다. 하지만, YO 투여군은 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 COMP 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 COMP 생성량이 증가하였다. 하지만, YO 투여군은 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 CTXⅡ 생성량을 측정한 결과, 대조군과 정상군의 그룹간의 차이가 나타나지 않았다. 하지만, YO 투여군은 대조군에 비해 500과 1000 실험군에서 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 calcitonin 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 calcitonin 생성량이 감소하였다. 하지만 YO 투여군은 대조군에 비해 500과 1000 실험군에서 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 glycosaminoglycan 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 glycosaminoglycan 생성량이 감소하였다. 하지만 YO 투여군은 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 직전 뒷발 체중 부하를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 체중 부하 비율이 감소하였다. 하지만 YO 투여군은 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YO 투여군은 대퇴골과 경골 사이의 연골 (Catilage, 노란색 원형 표기)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 YO 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다.
- 실험 종료 후 무릎 관절을 micro-CT로 정면과 측면을 촬영한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YO 투여군의 연골 양(Cartilage volume, 노란색 원형표기)이 감소되었고 대퇴골 하단 부위에 골의 부식과 파괴가 된 것이 확인되었으나 상대적으로 YO 투여군이 대조군에 비해 연골 양뿐만 아니라 골의 부식과 파괴가 적게 일어난 것이 관찰되었다(Fig. 7-A, B).
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YO 투여군은 대퇴골과 경골 사이의 연골 (Catilage, 노란색 원형 표기)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 YO 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 YO 투여군은 정상군에 비해 연골 주변으로 침윤세포가 많이 생성되어 있는 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 YO 투여군이 대조군에 비해 침윤세포의 범위나 밀집도가 적은 것이 확인되었다(Fig. 8).
- 무릎 관절의 Safranin-O 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YO 투여군은 연골 주변과 활막 내에 붉은 색으로 염색된 proteoglycan (노란색 화살표)이 고르게 형성되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었으나 대조군은 proteoglycan이 소실된 개체를 보인 반면, YO 투여군은 연골 주변과 활막내 proteoglycan의 분포가 많은 것이 확인되었다(Fig. 9).
- 특히, 연골 마모 정도를 측정하는 지표로 알려진 CTXⅡ의 농도의 증가는 무릎에서는 6배, 고관절에서는 8배 이상의 골관절염이 빠르게 진행된다는 연구결과18)가 있어, 관절염 발생에 대한 지표로써 중요하다고 할 수 있다. 본 연구 결과, 연산오계 투여군은 대조군에 비해 MMP-9, CTXⅡ (500, 1000 (㎎/㎏/day) 투여군), COMP 생성량이 유의성 있게 감소하여 관절 연골 및 골 파괴를 방어하는 것으로 나타났다.
- Calcitonin은 칼슘의 손실을 예방하고 치료하는 호르몬으로써 갑상선에서 분비되어 혈중 칼슘을 뼈로 유입하는 작용을 하며, glycosaminoglycan은 관절 연골의 주요 성분인 proteoglycan을 형성하고 관절연골에 탄력성을 제공한다19, 20). 본 연구 결과, 연산오계 투여군은 대조군에 비해 calcitonin (500, 1000(㎎/㎏/day) 투여군)과 glycosaminoglycan 생성을 정상군에 가깝게 증가시켜 골 강화에 도움을 주는 것으로 확인되었다.
- 이와 같은 골 파괴 및 강화 등의 골 대사 인자의 유의적인 혈액학적 결과는 실험 종료 직전 실시한 뒷발 부하 측정결과에서 확인되었으며, 더불어 micro-CT 및 조직병리 검사를 통해 연산오계 투여군이 대조군에 비해 연골 및 proteoglycan의 보존이 잘 되었고 동시에 골 파괴가 적게 일어난 결과들은 골관절염 예방과 개선에 효능이 있음을 더욱 뒷받침하고 있다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 연산오계는 전임상 실험을 통해 혈액 및 방사선, 조직학 등 다양한 골관절염 유관 인자에 대한 효능이 과학적으로 입증되었다. 다만, 다양한 연산오계 투여 용량 중 농도 의존적이지 않은 2000 ㎎/㎏/day의 결과는 약물의 주된 흡수 경로인 소화관에서의 다양한 변화를 통해 흡수율이 저해되어 나타난 결과로 판단되는 바 연산오계의 1000 ㎎/㎏/day 용량이 가장 효과적인 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 연산오계는 전임상 실험을 통해 혈액 및 방사선, 조직학 등 다양한 골관절염 유관 인자에 대한 효능이 과학적으로 입증되었다. 다만, 다양한 연산오계 투여 용량 중 농도 의존적이지 않은 2000 ㎎/㎏/day의 결과는 약물의 주된 흡수 경로인 소화관에서의 다양한 변화를 통해 흡수율이 저해되어 나타난 결과로 판단되는 바 연산오계의 1000 ㎎/㎏/day 용량이 가장 효과적인 것으로 생각된다. 또한, 연산오계가 현재 천연기념물 지정되어 있어 사육의 개체 수 제한과 저수익성으로 인해 수요가 적다는 한계점이 있지만13), 본 연구결과를 바탕으로 임상연구 결과가 보완된다면 연산오계는 골관절염에 대한 예방과 치료 효능을 가진 약용자원으로써 처방, 약침 등의 한의학적 신규 치료제와 죽, 음료 등의 건강기능성 식품 소재로 활용될 수 있다고 사료된다.
- 1. YO 투여군은 혈액 내 골 손실 인자인 MMP-9, COMP 생성량을, CTXⅡ 생성량은 500, 1000 (㎎/㎏/day) 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다.
- 2. YO 투여군은 혈액 내 골 형성 인자인 glycosaminoglycan 생성량을, 500, 1000 (㎎/㎏/day) 투여군은 calcitonin 생성량을 대조군에 비해 유의성 있게 증가시켰다.
- 3. YO 투여군은 체중부하 측정 시 대조군에 비해 유의성 있게 증가시켰다.
- 4. YO 투여군은 micro-CT 촬영 결과, 대조군에 비해 연골양 및 골 파괴가 적게 나타났다.
- 5. YO 투여군은 H&E 및 safranin-O 염색을 통한 조직 병리 검사에서 대조군에 비해 연골과 protoeoglycan의 보존이 잘 되었다.
- 이상의 결과들로 보아 연산오계는 골관절염 동물 모델을 통해 혈액 내 골 손실 및 골 형성 인자의 효능이 체중부하 측정, micro-CT, 조직 병리 결과를 통해 규명되다. 전체적인 결과에서 1000 ㎎/㎏/day의 투여가 가장 뛰어난 효능이 나타나 추후 임상적으로 엄격한 기준을 충족한 연구 진행 시 기초적 자료로 활용될 수 있으며, 연산오계가 골관절염에 대한 예방과 치료를 위한 소재로 활용될 수 있음을 시사하고 있다.
후속연구
- 다만, 다양한 연산오계 투여 용량 중 농도 의존적이지 않은 2000 ㎎/㎏/day의 결과는 약물의 주된 흡수 경로인 소화관에서의 다양한 변화를 통해 흡수율이 저해되어 나타난 결과로 판단되는 바 연산오계의 1000 ㎎/㎏/day 용량이 가장 효과적인 것으로 생각된다. 또한, 연산오계가 현재 천연기념물 지정되어 있어 사육의 개체 수 제한과 저수익성으로 인해 수요가 적다는 한계점이 있지만13), 본 연구결과를 바탕으로 임상연구 결과가 보완된다면 연산오계는 골관절염에 대한 예방과 치료 효능을 가진 약용자원으로써 처방, 약침 등의 한의학적 신규 치료제와 죽, 음료 등의 건강기능성 식품 소재로 활용될 수 있다고 사료된다.
- 이상의 결과들로 보아 연산오계는 골관절염 동물 모델을 통해 혈액 내 골 손실 및 골 형성 인자의 효능이 체중부하 측정, micro-CT, 조직 병리 결과를 통해 규명되다. 전체적인 결과에서 1000 ㎎/㎏/day의 투여가 가장 뛰어난 효능이 나타나 추후 임상적으로 엄격한 기준을 충족한 연구 진행 시 기초적 자료로 활용될 수 있으며, 연산오계가 골관절염에 대한 예방과 치료를 위한 소재로 활용될 수 있음을 시사하고 있다.
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