치자(梔子)의 규격 기준 모니터링 및 HPLC 표준크로마토그램 연구 Quality Monitoring of Specification Standard of Gardeniae Fructus in the Korean Pharmacopoeia and Studies HPLC Standard Chromatogram원문보기
Objectives : Gardeniae Fructus is a ripe fruit of Gardenia jasminoides Ellis, which has been used as traditional medicines for anti-inflammatory, diuretic, antipyretic, and antibacterial activity. The aim of this study was to compare of Gardeniae Fructus in South Korea collected during three years a...
Objectives : Gardeniae Fructus is a ripe fruit of Gardenia jasminoides Ellis, which has been used as traditional medicines for anti-inflammatory, diuretic, antipyretic, and antibacterial activity. The aim of this study was to compare of Gardeniae Fructus in South Korea collected during three years according to the standards in monographs of the Korean Pharmacopoeia Eleventh edition (KP11). Methods : 30 items of Gardeniae Fructus from two cultivation regions were classified into dried(n=15) & steamed (n=15) and tested according to the standards in monographs of the KP11. Gardeniae Fructus was carried out identification(comparison of colors, thin layer chromatography), heavy metals, residual pesticides, total ash, and assay registered at KP11. Add to we tested loss on dry, contents of ethanol-soluble extracts, and HPLC profiling. Results : In TLC chromatogram of identification test, the spot of gardenoside and geniposide were observed at $R_f$ value of about 0.3 and 0.5. Heavy metals and residual pesticides met the requirements of the standards for all samples. The results of total ash of each samples are measured maximum 4.87 %. According to HPLC for assay, the samples contain 4.80~6.10 % of geniposide and 0.45~1.83 % of gardenoside. Conclusion : We have verified the current specification standard of Gardeniae Fructus and standard that is not set. By the results, it is proposed a new draft of loss on drying and confirmed the content of gardenoside revised. HPLC standard chromatogram of Gardeniae Fructus is proposed. We hope that it will help the standardization of Gardeniae Fructus.
Objectives : Gardeniae Fructus is a ripe fruit of Gardenia jasminoides Ellis, which has been used as traditional medicines for anti-inflammatory, diuretic, antipyretic, and antibacterial activity. The aim of this study was to compare of Gardeniae Fructus in South Korea collected during three years according to the standards in monographs of the Korean Pharmacopoeia Eleventh edition (KP11). Methods : 30 items of Gardeniae Fructus from two cultivation regions were classified into dried(n=15) & steamed (n=15) and tested according to the standards in monographs of the KP11. Gardeniae Fructus was carried out identification(comparison of colors, thin layer chromatography), heavy metals, residual pesticides, total ash, and assay registered at KP11. Add to we tested loss on dry, contents of ethanol-soluble extracts, and HPLC profiling. Results : In TLC chromatogram of identification test, the spot of gardenoside and geniposide were observed at $R_f$ value of about 0.3 and 0.5. Heavy metals and residual pesticides met the requirements of the standards for all samples. The results of total ash of each samples are measured maximum 4.87 %. According to HPLC for assay, the samples contain 4.80~6.10 % of geniposide and 0.45~1.83 % of gardenoside. Conclusion : We have verified the current specification standard of Gardeniae Fructus and standard that is not set. By the results, it is proposed a new draft of loss on drying and confirmed the content of gardenoside revised. HPLC standard chromatogram of Gardeniae Fructus is proposed. We hope that it will help the standardization of Gardeniae Fructus.
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문제 정의
이 연구에서는 국내의 주요산지 2곳에서 재배한 梔子를 수집하여 그대로 건조한 것과 끓는 물에 데치거나 찐 것을 가지고KP111)중 일부 개정21)된 내용에 따라 확인시험, 순도시험(중금속, 잔류농약), 회분 및 정량법(Table 1)을 검토 평가함으로서 국내 치자의 품질을 확인하고, KP11의 미설정규격인 건조감량과 엑스함량은 재배품과 국내에서 유통되는 국내산 규격품을 모니터링한 결과를 발표하고 치자의 성분의 확인을 위한 HPLC 표준크로마토그램 결과를 제안하고자 한다.
제안 방법
KP11에 설정되어 있는 중크롬산칼륨액을 비교액으로 색의 비교법에 따라 시험하였고 따로 박층크로마토그래프법(TLC)은 KP11에 따라 치자표준생약을 표준품으로 하고 반점의 성분을 확인하기 위하여 geniposide, gardenoside를 표준품으로 추가하여 시험하였다.
국내산 재배 梔子를 주산지 2개 지역에서 수집하여 건조방법을 생건과 증건으로 구별하여 30개에 대해 KP11 설정 규격인 확인시험, 중금속, 잔류농약, 회분 및 정량법 항목과 미설정 규격인 건조감량, 엑스함량 및 HPLC 표준크로마토그램 검토한 결과와 국내에 유통되는 규격품 15개에 대해 KP11 미설정 규격인 건조감량과 엑스함량을 함께 검토한 결과는 다음과 같다.
중금속시험에 사용된 Microwave는 MARS-5(CEM,USA)이며 기기는 Optima 7300DV(Perkin Elmer, USA)와 MA-2(NIC, Japan)를 사용하였고, GC는 Aglient 6890A(USA), GC-MS는 Aglient 5973i(USA)를 사용하였다. 그리고 HPLC 프로파일링에 사용된 장비는 Agilent 1200 series(USA)의 Diode Array Detector로 구성된 HPLC system을 사용하였으며 Chemstation software를 통해 크로마토그램 data를 처리하였다. HPLC column은 Shiseido capcell pak(C18, 4.
KP11 생약시험법의 중금속항에 따라 시험하였다. 납, 비소, 카드뮴은 분석용 검체 0.5 g을 정확하게 달아 극초단파분해법으로 분해하여 ICP-MS를 사용하여 측정하였고 수은은 분석용 검체 100 mg을 정확하게 달아 자동수은분석기로 측정하였다.
따로 geniposide 표준품과 gardenoside 표준품 약 1.0 ㎎을 정밀하게 달아 희석시킨 메탄올(7 → 10)을 넣어 정확하게 1 ㎖로 하여 표준액으로 하고 액체크로마토그래프법으로 시험하였다.
추가로 검출된 반점의 성분을 확인을 위하여 표준품으로 geniposide, gardenoside를 각각 5 mg을 달아 메탄올 1mg에 녹여 표준액으로 하였다. 또한 발색할 때 자외선을 쪼여 확인하였다.
분석용검체 1 g 및 치자표준생약을 달아 각각 메탄올 20 ㎖를 넣고 수욕에서 3분간 가온하고 식힌 다음 여과하여 여액을 검액 및 치자표준생약표준액으로 하였다. 검액 및 치자표준생약표준액 10 ㎕씩을 박층크로마토그래프용실리카겔을 써서만든 박층판에 점적한 다음에 아세트산에틸·메탄올 혼합액(3 : 1)을 전개용매로 하여 약 10 ㎝ 전개한 다음 박층판을 바람에 말렸다.
총디디티(p,p'-DDD, p,p'-DDE, o,p'-DDT 및 p,p'-DDT의 합계), 디엘드린, 총비에이치씨(총BHC : α, β, γ및 δ-BHC의 합계), 알드린, 엔드린 성분으로 분석용검체 5 g을 정확하게 달아 균질기로 분쇄하고 실리카겔카트리지를 이용하여 정제한 액을 가지고 시험하였다.
p-아니스알데히드·황산시액을 고르게 뿌린다음 105℃에서 10 분 간 가열하였다. 추가로 검출된 반점의 성분을 확인을 위하여 표준품으로 geniposide, gardenoside를 각각 5 mg을 달아 메탄올 1mg에 녹여 표준액으로 하였다. 또한 발색할 때 자외선을 쪼여 확인하였다.
0 %에 대해서는 모두 기준보다 낮게 나타났다. 통계처리결과값과 JP17의 기준을 참고로 하여 건조감량을 13.0 % 이하로 신규 설정을 제안하고자 한다. 엑스함량의 경우 생건은 33.
대상 데이터
n=15)과 원통형 찜기를 이용하여 증기로 익을 때까지 찌고 온풍 건조기를 이용하여 60℃에서 12시간 건조한 것(이하증건(steamed)이라 함. n=15)을 구분하여 재배품 30개 시료를 대상으로 하였다(Table 2). 따로 국내에서 유통되는 국내산 규격품 (이하 유통품이라함, n=15)를 수집하여 KP11 미설정 규격인 건조감량과 엑스함량 모니터링에만 적용하였다.
기기분석에 사용한 용매 메탄올, 아세토니트릴은 액체크로마토그래프용 (Burdick& Jackson, USA)으로 구입하였고 물은 Milli-Q apparatus(Millipore, MA, USA)를 사용하여 3차 증류수 제조 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하여 사용하였다.
n=15)을 구분하여 재배품 30개 시료를 대상으로 하였다(Table 2). 따로 국내에서 유통되는 국내산 규격품 (이하 유통품이라함, n=15)를 수집하여 KP11 미설정 규격인 건조감량과 엑스함량 모니터링에만 적용하였다. 전 경희대학교 육창수, 안덕균교수가 기원을 감별하였고 한국의약품시험연구원에 보관하고 있다.
저울은 PB303-S(Mettler-Toledo, Switzerland)를 사용하여 계량하였다. 중금속시험에 사용된 Microwave는 MARS-5(CEM,USA)이며 기기는 Optima 7300DV(Perkin Elmer, USA)와 MA-2(NIC, Japan)를 사용하였고, GC는 Aglient 6890A(USA), GC-MS는 Aglient 5973i(USA)를 사용하였다. 그리고 HPLC 프로파일링에 사용된 장비는 Agilent 1200 series(USA)의 Diode Array Detector로 구성된 HPLC system을 사용하였으며 Chemstation software를 통해 크로마토그램 data를 처리하였다.
45 ㎛ membrane filter로 여과하여 사용하였다. 치자표준생약(Gardenia fruit Reference medicinal plants materials)은 치자나무 Gardenia jasminoides Ellis로서 식품의약품안전처에서 분양받았으며 표준품은 Geniposide(Wako, Japan), Gardenoside (TAUTO, China)를 구입하여 사용하였다. 추출에는 Ultrasonic DH.
확인시험에 사용된 시약은 국내·외 특급 및 일급시약을 구입하여 사용하였고 박층크로마토그래피에는 시판되고 있는 Silica gel 60 F254를 써서 만든 박층판(230-400 mesh,0.25 mm, Merck, USA) 을 사용하였다.
이론/모형
KP11 생약시험법의 잔류농약항에 따라 시험하였다. 총디디티(p,p'-DDD, p,p'-DDE, o,p'-DDT 및 p,p'-DDT의 합계), 디엘드린, 총비에이치씨(총BHC : α, β, γ및 δ-BHC의 합계), 알드린, 엔드린 성분으로 분석용검체 5 g을 정확하게 달아 균질기로 분쇄하고 실리카겔카트리지를 이용하여 정제한 액을 가지고 시험하였다.
KP11 생약시험법의 중금속항에 따라 시험하였다. 납, 비소, 카드뮴은 분석용 검체 0.
분석용 검체 약 3 g을 정밀하게 달아 KP11 생약시험법의 건조감량항에 따라 시험하였다
4) 회분
분석용 검체 약 3 g을 정밀하게 달아 KP11 생약시험법의 회분항에 따라 시험하였다.
0 ㎎을 정밀하게 달아 희석시킨 메탄올(7 → 10)을 넣어 정확하게 1 ㎖로 하여 표준액으로 하고 액체크로마토그래프법으로 시험하였다. 생약제제의 성분 프로파일 설정 가이드라인22)을 참고하였다. 분석조건은 Table 3.
성능/효과
1. 확인시험중 정성시험을 통해 크로신 색소를 확인하는 것으로 모든 시료가 중크롬산칼륨 비교액보다 진한 노란색을 나타냈으며, 박층크로마토그래프법에 따라 실시하여 그대로 건조한 것과 쪄서 말린 치자에서 Rf 값 0.3 부근에서 gardenoside 및 Rf 값 0.5 부근에서 geniposide의 반점임을 각각 확인할 수 있었다.
2. 순도시험중 중금속의 경우 납은 0.0∼0.5 ppm(0.2±0.09), 카드뮴은 0.04∼0.08 ppm(0.1±0.008), 비소는 0.0 ∼0.1 ppm(0±0), 수은은 0.00∼0.02 ppm(0.0±0.007)으로 30개 시료 모두 기준 미만으로 나타났다.
3. 건조감량의 경우 생건은 4.47∼5.69 %(4.98±0.38), 증건은 5.98∼6.86 %(6.48±0.26), 유통품은 4.37∼11.24 %(7.28±1.91)로 나타났다.
5. 엑스함량중 묽은에탄올엑스함량의 경우 33.53∼41.93 % (39.36±2.37), 증건은 38.07~42.17 %(40.97±1.83)로 균일하게 나타났으나 유통품의 경우 18.34∼40.35 %(33.92±6.11)로 편차가 있게 나타났다.
6. 정량법 시험결과 geniposide 함량은 생건의 경우 5.33 ∼6.10 %(5.74±0.35), 증은 4.80~5.61 %(5.09±0.20)로 지역별, 건조방법별 차이가 없었으며 KP11 규격 3.0 %보다 모두 높게 나타났다.
7. 치자의 HPLC 표준크로마토그램은 geniposidic acid,gardenoside 및 geniposide 성분에 해당하는 peak가각각 7.0 min, 8.7 min, 15,7 min에서 서로 간섭없이 관측되었으며 생건, 증건 30개 크로마토그램에서 주피크 6개의 유지시간(RT)과 상대유지시간(RRT)를 비교하였더니 표준편차와 상대표준편차가 1% 이하로 확인되었다. 건조방법별 각각 15개의 크로마토그램을 중첩한 결과 유사하게 나타남을 확인하였다.
KP11 규격에서 梔子의 중금속 기준은 납 5 ppm, 카드뮴 0.3 ppm, 비소 3 ppm, 수은 0.2 ppm 이하 설정되어 있으며, 시험결과 납은 0.0∼0.5 ppm(0.2±0.09), 카드뮴은 0.04∼0.08 ppm(0.1±0.008), 비소는 0.0∼0.1 ppm(0±0), 수은은0.00∼0.02 ppm(0.0±0.01)으로 30개 시료 모두 기준 미만으로 나타났다.
KP11 미설정규격인 건조감량의 경우 생건은 4.47∼5.69 %(4.98±0.38), 증건은 5.98∼6.86 % (6.48±0.26), 유통품은 4.37∼11.24 %(7.28±1.91)로 모든 시료가 ChP2015 기준인 8.5 % 이하로 적용하면 총 45개 중 유통품 6개가 기준을 초과하는 것으로 나타났으나 JP17 기준인13.0 %에 대해서는 모두 기준보다 낮게 나타났다.
KP11에 설정되어 있는 梔子의 확인시험 ① 색의 비교방법은 중크롬산칼륨액을 비교액으로 하여 크로신 색소를 확인하는 것으로 생건, 증건시료 모두 비교액보다 진한 노란색을 나타내어 차이가 없었으며 박층크로마토그래프법에 따른 확인시험 ② 박층크로마토그래프법(TLC)은 식약처에서 분양받은 치자표준생약, 그대로 건조한 생건과 쪄서 말린 증건 시료를 가지고 gardenoside 표준품 및 geniposide 표준품과 비교 시험한결과 검액에서 얻은 반점은 치자표준생약표준액에서 얻은 반점과 색상 및 Rf 값이 같고, 그 중 Rf 값 0.3 부근에서gardenoside 및 Rf 값 0.5 부근에서 geniposide 의 반점임을 각각 확인할 수 있었다. 중금속 시험결과 납, 비소, 카드뮴 및 수은의 오염도는 매우 낮은 것으로 나타났으며 잔류농약 시험결과 KP11에서 규정하고 있는 총DDT등이 검출되지 않았다.
geniposide, gardenoside 및 geniposidic acid 표준액을 가지고 설정한 분석조건(Table 3)에 따라 시험하였을 때 서로 간섭없이 분리되고 geniposidic acid, gardenoside,geniposide 순으로 유출됨을 확인하였다(Figure 7).
p-아니스알데히드·황산시액을 발색제로 하여 시험 할 때 검액에서 얻은 여러 개의 반점은 치자표준생약표준액에서 얻은 반점과 색상 및 Rf 값이 같았고, 그 중 Rf 값 0.3 부근에서gardenoside, Rf 값 0.5 부근에서 geniposide의 반점을 각각 확인할 수 있었다.
분석조건에 따라 80분 동안 분석하였을 때 생건, 증건 모두에서 20분안에 geniposidic acid, gardenoside, geniposide로 피크가 유출되었다. 표준크로마토그램은 30분까지의 크로마토그램을 확대하여 제시하였다(Figure 10).
표준크로마토그램은 30분까지의 크로마토그램을 확대하여 제시하였다(Figure 10). 생건, 증건 30개 크로마토그램에서 주피크 6개의 유지시간(RT)과 상대유지시간(RRT)를 비교하였더니 표준편차와 상대표준편차가 1% 이하로 확인되었다(Table 4). 또한 크로마토그램을 건조방법별 중첩하여 확인한 결과 품목간의 패턴 차이없이 피크들이 반복적으로 검출됨을 알 수 있다(Figure 11).
생건은 4.47 ∼5.69 %(4.98±0.38), 증건은 5.98∼6.86 %(6.48±0.26), 유통품은 4.37∼11.24 %(7.28±1.91)로 모든 시료가 ChP2015 기준인 8.5 % 이하로 적용하면 총 45개 중 유통품 6개가 기준을 초과하는 것으로 나타났으나 JP17 기준인 13.0 %에 대해서는 모두 기준보다 낮게 나타났다.
01 ppm 이하로 규정하고 있다. 시험결과 모든 시료에서 농약 성분이 검출되지 않았다.
재배품 30개 시료에 대해 지표물질인 geniposide 와 gardenoside를 표준품으로 검량선법과 액체크로마토그래프법에 따라 시험한 결과 geniposide 함량은 생건의 경우 5.33 ∼6.10 %(5.74±0.35), 증건의 경우 4.80∼5.61 %(5.09±0.20)로 지역별, 건조방법별 차이가 없었으며 KP11 규격 3.0 %보다 모두 높게 나타났다(Figure 8).2)
정량법 시험결과 geniposide함량은 생건의 경우 5.33∼6.10 %(5.74±0.35), 증건의 경우 4.80~5.61 %(5.09±0.20)로 지역별, 건조방법별 차이가 없었으며 KP11 규격 3.0 %보다 모두 높게 나타났다 gardenoside 함량은 생건은 1.00∼1.83 %(1.51±0.32)로 나타났고 고흥지역이 남해지역보다 함량이 높게 나타났다.
5 부근에서 geniposide 의 반점임을 각각 확인할 수 있었다. 중금속 시험결과 납, 비소, 카드뮴 및 수은의 오염도는 매우 낮은 것으로 나타났으며 잔류농약 시험결과 KP11에서 규정하고 있는 총DDT등이 검출되지 않았다. 회분시험결과 4.
09)로 지역간 차이 없이 낮게 검출되었다(Figure 9). 치자열매를 쪄서 말리는 방법으로 건조한 것이 그대로 건조한 치자보다 gardenoside 함량이 감소됨을 알 수 있었다. 건조방법에 따라 함량의 차이가 크게 나타남을 알 수 있었다.
국내에서 재배하고 있고 치자열매를 수집하여 공정서의 가공방법에 따라 가공한 梔子에 대한 현행 공정서인 KP11의 규격 및 미설정 규격을 모니터링하고 JP, ChP의 규격 기준과 비교 검토한 자료이고 유통품 梔子에 대해 KP11 미설정 규격을 모니터링한 결과와 표준크로마토그램 연구 결과는 梔子의 품질관리의 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
치자 추출물의 효과는 무엇인가?
생체 노화는 물론, 암을 비롯한 동맥경화, 뇌졸중, 파킨슨병과 같이 활성산소가 인체에 미치는 영향이 연구됨에 따라10) 항산화작용 등 활성산소 소거제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 butylatedhydroxytoluene(BHT)나 butylated hydroxyanisole(BHA)와 같은 합성 활성산소 소거제보다는 비교적 인체에 안전한 천연 활성산소소거제로서 梔子에 관한 연구가 이루어지고 있다11). 그 밖에도 치자 추출물은 담즙분비를 촉진하고12), 약물성간장해에 대한 보호작용13), 혈청트리글리세라이드, 인지질, 지질과산화물, 혈당, 유리지방산의 감소에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며14), 동맥경화 예방 효과에 대한 연구가 발표되고 있다15). 식품 착색제나 면직물 염료 등에 치자를 쓰는경우에는 치자에 포함되어 있는 크로신(crocin)이라는 황색계열의 수용성 색소를 이용하여 노란색의 물을 들이거나16) 치자로부터 비색소성분인 geniposide를 분리·정제한 후 β-glucosidase로 가수분해하여 얻은 genipin을 아미노산과반응시켜 수용성 청색소로 전환하여 사용하기도 한다17-18).
치자란 무엇인가?
梔子(Gardeniae Fructus, Gardenia Fruit)는 대한민국약전(KP11)1), 일본약국방(JP17)2)과 중화인민공화국약전(ChP2015)3) 에 “치자나무 Gardenia jasminoides Ellis(꼭두서니과 Rubiaceae)의 열매”로 되어있다. 우리나라 공정서에는 KP24)에 “치자나무 Gardenia jasminoides Ellis 및 동속식물의 열매”로 처음 수재되었다.
우리나라 치자의 수확시기는 언제인가?
이 지역 이상의 위도에서 재배할 경우 겨울한파시 동해가 우려된다. 일반적으로 10월 중순이후 가을 늦서리가 내린 후에 열매가 주황색으로 변했을 때 수확해야한다. 수확한 열매는 과병, 꽃받침을 제거하고 하루정도 건조하기도 하고 솥 위에 물에 닿지 않는 장치를 하고 치자를 넣고 증기를 쐬어 준 후 이것을 꺼내어 서늘한 곳에서 건조하는 증숙건조방법이 있다.
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