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문제 정의
- 은 수경의 락혈에 침자를 깊이별로 시행했을 때 혈위 마다 각 깊이별로 NO, NOS, NE의 발현 정도가 차이가 있어 경혈 자극시 적절한 깊이가 경혈의 국소적인 연계작용이 신경전달계에 영향을 미칠 것이라고 보고하였으나, 추후 연구가 필요하다고 하였 다. 이에 본 연구에서는 족삼음경의 락혈에 깊이별로 침 자극을 시행하였을 때 NO, nNOS, eNOS, iNOS, NE의 발현을 통해 경혈의 국소 작용을 관찰하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 족삼음경의 락혈에 침자를 표층, 중간층, 심층의 깊이별로 시술하여 해당 부위의 NO와 NOS 및 NE 발현을 관찰한 바, 다음과 같은 지견을 얻었다.
제안 방법
- 1 M PBS로 3번 세척한 다음 실온에서 40분간 Streptavidin peroxidasepreformed complex(Quick Kit : VectorLaboratories, USA)에 담구었다. 0.1 M PBS로 3회 정도 세척한 조직을 diaminobenzidine(DAB)을 사용하여 발색시키고, 0.1 M PB로 발색된 것을 정지 시킨 다음 Hematoxyline으로 대조 염색 과정을 거친 후 슬라이드를 dehydtration한 후에 광학현미경 (Nikon, Japan)을 이용하여 200배율로 관찰하였다.
- 1) 취혈 및 자침: 족삼음경의 絡穴에 해당하는 3개 혈위에 대하여 Koo 등14)과 WHO 표준경혈위치 등15)의 기준을 참고하여 인체와 상응한 부위로 취혈하였다.
- 2) 실험군: 각 실험군들은 군당 5마리씩 사육부터 실험 종료까지 실험기간의 전 과정을 동일하게 처치되었으나, 족경의 각 경락에 해당하는 絡穴인 족태음비경의 公孫(SP4), 족소음신경의 大鍾(KI4), 족궐음간경의 蠡溝(LR5)으로 3개의 군으로 구분한 후 각 혈위에서 superficial Layer, middle Layer, deep Layer 등 3개 깊이로 분리하여 실험하였다.
- 2) 조직 준비: NE production을 얻기 위한 피부조직은 자침 시와 동일하게 버니어 캘리퍼스를 사용하여 해당 락혈 부위를 포함하는 조직을 자침 위치에서 1 mm×1 mm×1 mm 크기로 적출하여 0.1 M perchloric acid 500 μl와 homogenize(KIKA Works[Asia] Sdn. Malaysia)하고, 이를 10,000 g에서 20분 동안 4°C에서 원심 분리를(Centrifuge 5415R, Germany)하여 supernatant를 분리하였다.
- 3) NO 측정: 락혈 부위의 조직 내 NO 함량을 측정하기 위해 Griess 시약을 이용하여 NO2¯와 NO3¯을 분석하였다.
- 4) 조직학적 관찰: 락혈 부위의 광학현미경 관찰을 위하여 채혈을 끝낸 실험동물의 락혈 부위 조직을 적출하여 bouin solution(Sigma, Germany) 용액에 24시간 동안 고정시킨 다음, 50% ethanol∼100% ethanol II, ethanol/xylen(1:2)액에 각각 1시간 동안 통과시켜 탈수하고 60°C incubator에서 xylen/paraffin(1:1)과 xylen/paraffin(1:2), xylen/paraffin(1:3) 및 hard paraffin 용액으로 2시간씩 처리한 후 paraffin mold에 포매하였다.
- 5) 면역조직화학 측정: 절편 제작한 조직을 0.1 M PBS에 3회 세척하였고, 2% rabbit 혈청으로 40분 blocking을 한 후, 각각 Rabbit anti-nNOS(Invitrogen, USA)와 anti-iNOS(Abcam, England) 를 각각 1:100 배율로, anti-eNOS(Abcam, England)는 1:200배율로 andtibody를 사용하였다. 1차 항체는 0.
- 6) Norepinephrine 분석: LC-MS/MS를 활용한 norepinephrine 분석 : 1,200 series LC(Agilent, USA)와 연결된 6,410 MS(Agilent, USA)를 사용하며, positive electrospray ionization(ESI) mode로 분석을 실시하였고, Column은 YMC-Pack Pro C8을 사용하였으 며, 이동상으로 5 mm 정도의 0.1% formic acid 및 ammonium acetate가 혼합된 증류수(A)와 5 mm 정도의 0.1% formic acid 및 ammonium acetate가 혼합된 methanol(B)을 Table-0과 같은 조건으로 0.3 ml/min의 유속을 사용하였다.
- Paraffin 처리된 조직은 Rotary microtome(RMC Product, USA)을 사용하여 6∼7 μm 두께로 절편을 제작한 후 hematoxylin-eosin 으로 염색하고, 광학 현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 100배율로 관찰하였다.
- 각 물질의 함량은 표준물질 2.5 ppm, 0.50 ppm, 0.125 ppm(μg/ml)을 standard로 하여 작성한 검량선을 사용함으로 시료 중 함량을 계산하였다.
- 사육되는 동물은 12시간 간격으로 명암조절이 되었고, 항온 항습(23±1°C, 50±10%)이 유지되는 사육 환경에서 사육하였고 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험동물을 침자전에 80% 산소와 20% 질소가 혼합되어 있는 가스에 5% isoflurane(Choongwae, Korea)을 사용하여 호흡마취를 유지시킨 후 숙련된 전문가 1인이 침자를 시행하였고, 이때 SP4혈과, KI4혈의 superficial layer군의 침자 깊이는 지각층으로 피부에서 약 0.5 mm, middle layer군의 침자 깊이는 진피층으로 약 1 mm, deep layer군의 침자 깊이는 진피하층으로 약 2 mm로, LR5혈의 superficial layer군의 침자 깊이는 지각층으로 피부에서 약 1 mm, middle layer군의 침자 깊이는 진피층으로 약 2 mm, deep layer군의 침자 깊이는 진피하층으로 약 3 mm로 수직으로 자침하고, 3분간 유침하였으며, 호침(0.25×15 mm, Dongbang, Korea)을 사용하였다.
- Paraffin 처리된 조직은 Rotary microtome(RMC Product, USA)을 사용하여 6∼7 μm 두께로 절편을 제작한 후 hematoxylin-eosin 으로 염색하고, 광학 현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 100배율로 관찰하였다. 염색된 각각의 NOS-positive cell은 육안으로 관찰하여 연구자 2인이 개수를 counting하였다.
- 25×15 mm, Dongbang, Korea)을 사용하였다. 정확한 깊이에 자침하기 위한 방법으로 버니어 캘리퍼스를 사용하여 사용되는 호침마다 깊이 표시를 하여 자침하였다(Fig. 1).
- 조직의 단백질 시료 40 μl와 MOPS buffer(pH 7.0, 50 mm MOPS/1 mm EDTA) 45 μl를 혼합한 후 reconstituted E.coli nitrate reductase(500 μl MOPS buffer에 1 unit nitrate reductase가 용해된 농도) 5 μl를 더하고 2 mm NADH 10 μl를 가하여 20분 동안 실온에서 반응시키고 50 μl Griess reagent A와 반응시킨 다음, 50 μl Griess reagent B와 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후에, purple azo dye가 생성이 되면 Micro plate reader(Spectra max m2e, USA)로 540 nm에서 흡수율을 측정하였으며, NaNO3표준곡선을 기준으로 Nitrite 농도를 계산하였다.
- 족태음비경의 공손(SP4), 족소음신경의 대종(KI4), 족궐음간경의 여구(LR5)에 시술한 침자가 해당 혈위의 조직 내 NO, nNOS, eNOS, iNOS 발현과 NE 변화에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 1) 실험 동물: 실험 동물은 400∼450 g 16주령의 Sprague– Dawley계 수컷 rats(Samtaco, Korea)을 사용하였으며, 동신대학교 동물실험윤리에 따라 사육 및 처치하였다(동물실험 승인번호:2015-06-03).
- 조직 샘플은 1차 항혈청에 4°C를 유지하며 60시간 동안 배양하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 모든 측정값은 Excel program(Microsoft, USA)을 이용하였고 평균치와 표준 오차값(mean±standard error)을 표시하였다.
- 본 연구에서 모든 측정값은 Excel program(Microsoft, USA)을 이용하였고 평균치와 표준 오차값(mean±standard error)을 표시하였다. 실험군들 간의 통계학적 분석은 SPSS 21 ver. for windows를 사용하여 하였고, 비모수적인 방법으로는 Mann-Whitney U test를 시행하였다. 실험의 분석에서 각 실험군은 무처치군에 비하여 p＜0.
- for windows를 사용하여 하였고, 비모수적인 방법으로는 Mann-Whitney U test를 시행하였다. 실험의 분석에서 각 실험군은 무처치군에 비하여 p＜0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 1. NO 발현에서 무처치군에 비하여 KI4군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었다.
- 2. nNOS 발현에서 무처치군에 비하여 SP4군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었고, KI4군은 superficial layer에서 유의한 증가를 나타내었다.
- 3. eNOS 발현에서 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었다.
- 4. iNOS 발현에서 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었다.
- 5. Norepinephrine 발현에서 무처치군에 비하여 SP4군은 superficial layer에서 유의한 감소를 나타내었고, LR5군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었다.
- NO발현에 대한 변화를 침자의 깊이별로 관찰한 결과, 무처치군에 비하여 KI4군은 깊이별로 모두 유의한(p＜0.01) 증가를 나타내 었으며, SP4군과 LR5군은 깊이별로 유의한 차이를 나타내지 않았 다(Fig. 2).
- Norepinephrine 발현에 대한 변화를 침자의 깊이별로 관찰한 결과, 무처치군에 비하여 SP4군은 superficial layer에서 유의한(p ＜0.05)은 감소를 나타내었고, LR5군은 깊이별로 모두 유의한(p ＜0.01)이 증가를 나타내었으며, KI4군은 미량의 검출로 인하여 유의성을 평가할 수 없었다(Fig. 9).
- eNOS 발현에 대한 변화를 침자의 깊이별로 관찰한 결과, 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군은 깊이별로 모두 유의한(p＜ 0.01) 증가를 나타내었다(Figs. 5, 6).
- iNOS 발현에 대한 변화를 침자의 깊이별로 관찰한 결과, 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군은 깊이별로 모두 유의한(p＜ 0.01) 증가를 나타내었다(Figs. 7, 8).
- nNOS 발현에 대한 변화를 침자의 깊이별로 관찰한 결과, 무처치군에 비하여 SP4군이 깊이별로 모두 유의한(p＜0.01) 증가를 나타내었으며, KI4군은 superficial layer에서 유의한 (p＜0.01)이 증가를 나타내었으며, LR5군은 깊이별로 유의한 차이를 나타내지 않았다(Figs. 3, 4).
- 각각의 조직 내 NO, nNOS, eNOS, iNOS, NE의 발현을 종합하였을 때, NO의 경우 근육, 건, 신경 등 여러 조직이 분포되어있는 KI4와 같은 혈위에서 높은 발현을 나타내었으며, NOS, eNOS, iNOS의 경우 깊은 부위에서 높은 발현을 나타내었고, NE의 발현의 경우 조직이 많은 혈위에서 높은 발현을 나타내었다.
- 본 연구에서 조직 내 NO 함량 변화의 경우 무처치군에 비하여 KI4군이 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었으며 깊이가 깊어 질수록 감소하였다. 침자를 시행하기 전과 후의 NO 함량 변화에 미치는 영향을 비교한 Kim9)의 연구에서도 KI4 침자 시행 전과 후의 차이를 나타내었다.
- 침자를 시행하기 전과 후의 혈위 조직 내 nNOS 함량 변화에 미치는 영향을 비교한 Kim9)과 Choi10)의 연구에서는 대부분의 혈위에서 감소를 나타내었으며, 깊이별로 침자를 시행한 후 혈위 조직 내 nNOS 함량 변화를 관찰한 Lee 등2)과 Shin 등13)의 연구에서는 middle layer와 deep layer에서 유의함을 나타내었다. 수경에 비해 족경에서 침자 전과 후의 nNOS 함량 변화 차이가 뚜렷함을 나타내었고, nNOS 함량 변화는 수경의 경우 양경은 증가를, 음경은 감소를 나타내었으며 족경은 수경과 반대 경향을 나타내었다.
- 이상의 결과로 보아 얇은 깊이의 피부 표면보다는 조직이 많이 함유되어 있는 깊은 깊이에서 발현이 증가함을 나타내었고, 혈위 선택과 침자 깊이 조절을 통해 치료에 적합한 NO와 NOS 및 NE분비를 조절이 가능할 것으로 사료된다.
- 조직 내 eNOS 발현의 경우 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군이 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었으며, superficial layer에 비해 middle layer와 deep layer에서 특히 높았다.
- 조직 내 iNOS 발현의 경우 무처치군에 비하여 SP4군, KI4군, LR5군은 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었으며, superficial layer에 비해 middle layer와 deep layer에서 특히 높았다.
- 조직 내 nNOS 발현의 경우 무처치군에 비하여 SP4군이 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었으며 superficial layer에 비해 middle layer와 deep layer에서 특히 높았으며, superficial layer 에서는 KI4군이 증가를 나타내었다. 침자를 시행하기 전과 후의 혈위 조직 내 nNOS 함량 변화에 미치는 영향을 비교한 Kim9)과 Choi10)의 연구에서는 대부분의 혈위에서 감소를 나타내었으며, 깊이별로 침자를 시행한 후 혈위 조직 내 nNOS 함량 변화를 관찰한 Lee 등2)과 Shin 등13)의 연구에서는 middle layer와 deep layer에서 유의함을 나타내었다.
- 조직 내 norepinephrine 함량 변화의 경우 무처치군에 비하여 LR5군이 모든 깊이에서 유의한 증가를 나타내었으며, SP4군은 superficial layer에서 감소를 나타내었고, KI4군에서는 매우 낮은 검출로 인하여 증감을 평가하기가 어려움이 있었다. Choi10)의 연구 에서도 LC-MS/MS 검출 한계에 미치지 못할 정도로 tissue의 norepinephrine 양이 극소량으로 존재하여 변화가 관찰되지 않았다는 보고와 관련되는 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구를 통해 이혈위에 대하여 위치와 깊이에 따른 자극을 조절함으로 생체 내 변화를 줄 수 있다면 경혈 자극을 통해 일어나는 침 치료에 대한 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 iNOS의 발현은 염증과도 관련이 있어 염증 유발을 통한 경혈로서의 기능 향상에 대한 가설이나 유침 외 수기법 등에 의한 경혈의 국소반응의 관찰을 위한 NO, nNOS, eNOS, iNOS, NE와 같은 신경전달물질의 발현에 대해 다양한 혈위를 적용한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 경혈을 이용한 치료는 장부와 연결된 각 혈위를 자극함으로 해당 환부의 치료 및 통증 감소의 효과를 준다. 본 연구를 통해 이혈위에 대하여 위치와 깊이에 따른 자극을 조절함으로 생체 내 변화를 줄 수 있다면 경혈 자극을 통해 일어나는 침 치료에 대한 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 iNOS의 발현은 염증과도 관련이 있어 염증 유발을 통한 경혈로서의 기능 향상에 대한 가설이나 유침 외 수기법 등에 의한 경혈의 국소반응의 관찰을 위한 NO, nNOS, eNOS, iNOS, NE와 같은 신경전달물질의 발현에 대해 다양한 혈위를 적용한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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