선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이와 같이 닭의 난각 형성에는 여러 복합적인 요인들이 작용하는데, 대사적 측면에서 이에 관여하는 유전자와 난각단백질 유전자 간의 상호관계를 탐색하고, 닭의 노화에 따른 이들 유전자들의 발현 정도의 변화를 구명하는 것은 난각질 개선을 위해 매우 유용한 연구라 하겠다. 따라서 본 연구에서는 닭의 산란연령 증가에 따른 자궁내막조직의 변화양상과 난각 형성에 관여하는 주요 유전자들의 상호관계 및 발현 양상을 비교 고찰하고자 하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA)용액으로 고정처리 하였다. 24시간 고정시킨 조직은 자동침투기(Model Microrn STP 120, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)를 이용하여 조직표본을 제작하였다. 조직의 수세, 탈수, 투명작업 후 paraffin 침투가 완료된 조직은 포매 작업대(Model Histostar, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)를 이용하여 포매를 시행하였다.
- Quantitative-PCR은 real-time PCR machine(Model LC480, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 cDNA 5 μL(10 ng/μL), primer(5 pmol/μL) 각각 0.5μL, SYBR Green(Roche, GmbH, Mannheim, Germany) 10μL, ddH2O 5 μL를 넣어 최종 volume이 20 μL가 되도록 하였다.
- 이를 위해 개체별 채혈한 전혈을 이용하여 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)로 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 위한 primer 제작은 primer-dimer가 형성되지 않도록 하고, refer- ence gene(18S RNA) 및 telomere, 난각 형성 관련 유전자를 분석 대상유전자로 하였다(Table 1). Quantitative-PCR은 real-time PCR machine(Model LC480, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 cDNA 5 μL(10 ng/μL), primer(5 pmol/μL) 각각 0.
- 5(Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 분석하였고, 각 표적유전자의 상대적 정량값은 Livak and Schmittgen(2001)이 제시한 2－△△Ct방법으로 분석하였다. Telomere 및 난각 관련 유전자의 발현값은 30주령의 특정 값(1.0)을 기준으로 상대적인 2－△△Ct값을 제시하였다.
- 공시계의 혈중 이온 분석을 위하여 개체의 익 정맥에서 혈액을 채취하였고, 혈액 내 Ca2+, Na+, K+, Cl－ 이온 함량을 분석하였다. 채취된 혈액은 1,500 rpm에서 20분간 원심분리를 실시하였고, 상층의 혈청(serum)을 수거 후 분석에 이용하였다.
- 닭의 산란 연령에 따른 난각 형성 관련 유전자들 간의 연관성을 살펴보고자 이들 간의 상관계수를 추정하였다. Table 3은 난각 단백질 유전자 발현량 간 상관관계를 분석한 결과로서, OCX-32, OCX-36 및 OC-17간에는 정의 상관을, OC-116과는 낮은 부의 상관을 보이나, 모든 계수가 유의하지 않았다.
- 5μL, SYBR Green(Roche, GmbH, Mannheim, Germany) 10μL, ddH2O 5 μL를 넣어 최종 volume이 20 μL가 되도록 하였다. 반응조건은 95℃에서 5분 처리하여 최초 변성시킨 후, 95℃ 10초 변성, 60℃ 30초 접합, 72℃ 10초간 신장 반응을 40회 반복하면서 진행하고, 실시간 형광 모니터링하였다. Tm값의 측정은 LightCyclerⓇ 480 software v1.
- 조직의 염색은 퇴행성 염색으로 과 염색 후 필요에 따라 탈색하였다. 염색이 완료된 후 저농도에서 고농도의 alcohol을 거쳐 탈수를 하고, xylene으로 굴절율을 높이는 투명과정을 거쳤다. 제작이 완료된 시료는 permount로 봉입한 후 검경하였다.
- Telomere 및 난각 관련 유전자 발현 분석을 위하여 quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)을 시행하였다. 이를 위해 개체별 채혈한 전혈을 이용하여 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)로 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 위한 primer 제작은 primer-dimer가 형성되지 않도록 하고, refer- ence gene(18S RNA) 및 telomere, 난각 형성 관련 유전자를 분석 대상유전자로 하였다(Table 1).
- 24시간 고정시킨 조직은 자동침투기(Model Microrn STP 120, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)를 이용하여 조직표본을 제작하였다. 조직의 수세, 탈수, 투명작업 후 paraffin 침투가 완료된 조직은 포매 작업대(Model Histostar, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)를 이용하여 포매를 시행하였다. 이 때 관찰 부위가 박절이 될 수 있도록 하향하고, 제작이 완료된 표본은 회전형 박절기(Model Jung Histocut 820, Leica, Nussloch, Germany)로 박절하였다.
- 제작된 표본의 핵과 세포질의 염색 과정은 먼저 xylene으로 탈 paraffin 과정 후 고농도에서 저농도의 alcohol로 함수시키고, 표본을 hematoxylin-eosin solution(Muto, Tokyo,Japan)으로 염색하였다. 조직의 염색은 퇴행성 염색으로 과 염색 후 필요에 따라 탈색하였다. 염색이 완료된 후 저농도에서 고농도의 alcohol을 거쳐 탈수를 하고, xylene으로 굴절율을 높이는 투명과정을 거쳤다.
대상 데이터
- 공시계의 조직표본제작은 30주령 및 60주령 개체를 대상으로 하루 중 난각 형성 완료 시점에 개체를 도살하고, 멸균된 가위로 자궁의 체부 위주로 조직을 채취하였다. 채취된 조직은 D-PBS 용액에 2회 세척 후 조직 크기의 20배 정도 양의 10% Formalin(Sigma, St.
- 본 시험에 이용된 공시동물은 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화하여 사육 중인 단관백색레그혼종(Single Comb White Leghorn)으로, 공시계는 케이지 육추 후 16주령부터 펜(pen)형태의 평사에서 방 당 100수씩(♀ 90:♂ 10) 혼합사육하였으며, 자유 급이 및 자유 급수 하였다. 시험분석은 미성숙 시기인 10주령, 산란 피크 시기인 30주령 및 산란 후기인 60주령의 개체 각 10수씩을 대상으로 하였으며, 시료는 산란개체의 경우 하루 중 난각 형성 말기 시점에 맞춰 채혈하고 도살 후 조직을 채취하였다.
- 10) 혼합사육하였으며, 자유 급이 및 자유 급수 하였다. 시험분석은 미성숙 시기인 10주령, 산란 피크 시기인 30주령 및 산란 후기인 60주령의 개체 각 10수씩을 대상으로 하였으며, 시료는 산란개체의 경우 하루 중 난각 형성 말기 시점에 맞춰 채혈하고 도살 후 조직을 채취하였다. 시험에 관련된 닭의 관리 및 취급은 본 기관의 동물실험윤리위원회(IACUC)의 규정을 준수하여 시행하였다.
데이터처리
- , Cary, NC, USA)의 ANOVA-one way procedure를 이용하여 연령별 분석 값 간의 유의성을 검정하고, 각 항목별 연령 간 평균값의 비교는 Tukey 방법으로 검정하였다. 연령에 따른 난각 형성유전자 발현값 간의 상관관계는 동일 통계패키지의 Correlation Procedure를 이용하여 상관계수를 추정하고, 이의 유의성을 검정하였다.
- 텔로미어, 난각 관련 유전자의 발현율 및 혈중 이온 농도의 통계 분석은 SAS 통계패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 ANOVA-one way procedure를 이용하여 연령별 분석 값 간의 유의성을 검정하고, 각 항목별 연령 간 평균값의 비교는 Tukey 방법으로 검정하였다. 연령에 따른 난각 형성유전자 발현값 간의 상관관계는 동일 통계패키지의 Correlation Procedure를 이용하여 상관계수를 추정하고, 이의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Telomere 및 난각 관련 유전자 발현 분석을 위하여 quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)을 시행하였다. 이를 위해 개체별 채혈한 전혈을 이용하여 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)로 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하였다.
- 반응조건은 95℃에서 5분 처리하여 최초 변성시킨 후, 95℃ 10초 변성, 60℃ 30초 접합, 72℃ 10초간 신장 반응을 40회 반복하면서 진행하고, 실시간 형광 모니터링하였다. Tm값의 측정은 LightCyclerⓇ 480 software v1.5(Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 분석하였고, 각 표적유전자의 상대적 정량값은 Livak and Schmittgen(2001)이 제시한 2－△△Ct방법으로 분석하였다. Telomere 및 난각 관련 유전자의 발현값은 30주령의 특정 값(1.
- 채취된 혈액은 1,500 rpm에서 20분간 원심분리를 실시하였고, 상층의 혈청(serum)을 수거 후 분석에 이용하였다. 분석방법은 Olympus AU2700(Olympus Medical Engin- eering Company, Japan)을 사용하여 디지털 광학계-후 분광 방식의 분광광도 원리를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 3은 산란연령에 따른 난각 단백질 관련 유전자들의 발현양상을 제시한 것으로, OC-17 및 OC-116 유전자는 산란 이전 시기에 발현이 전혀 보이지 않았고, OCX-36 유전자는 연령이 증가함에 따라 발현량의 유의적 증가를 나타내었다. Fig. 4는 산란연령에 따른 난각 이온 관련 유전자들의 발현양상으로 난각 단백질 관련 유전자들의 발현양상과 마찬가지로 SPP1 유전자의 경우 10주령에서 유전자의 발현이 전혀 보이지 않았으며, 산란연령이 증가함에 따라 ATP2A2, SCNN1G 및 CA2 유전자 발현량은 유의적 증가를 보였다.
- , 2005; Sohn and Subramani, 2014). 난각 관련 유전자들의 발현양상을 분석한 결과, 난각 단백질 유전자인 OC-17과 OC-116 및 난각 이온유전자인 SPP1은 산란 이전 시기에 발현이 없는 것으로 나타났다. Ovocleidin-17(OC-17)은 C-type의 lectin-like protein으로서 난각 무기질화에 있어 calcium carbonate의 침착을 조절하여 난각 강도에 영향을 미치고, 특히 산란 개시시기에 활발하게 작용하는 것으로 알려져 있다(Reyes-Grajeda et al.
- 따라서 OCX-32와 OC-17 및 OCX-36 유전자 모두 산란 전 기간에 걸쳐 난각 강도에 영향을 미치는 유전자로 사료되고, 난각 형성에 각기 독립적으로 작용하는 것으로 보인다. 난각 관련 이온유전자들 간 상관관계에서 ATP2A2, SCNN1G, CA2, CALM1 유전자 상호간 높은 정의 상관을 확인하였다. ATP2A2는 자궁세포 내 소포체에서 Ca2+ 이온의 이동, 농도 유지 및 항상성에 기여하고, SCNN1G는 Na+ channel로서 Ca2+와의 교환 및 자궁 내 Na+대사에 관여하며, CA2는 자궁세포에서 HCO3－를 형성하여 난각의 무기 질화에 관여한다.
- 따라서 10주령의 경우, 미성숙 시기로 산란을 하지 않기 때문에 OC-17, OC-116 및 SPP1 유전자의 발현이 보이지 않는 것을 알 수 있다. 난각 단백질 관련 OCX-36 유전자와 난각 이온관련 ATP2A2, SCNN1G, CA2 유전자는 연령이 증가함에 따라 유전자의 발현량이 유의적으로 증가하였다. OCX-36은 큐티클 층 형성에 관여하는 단백질로 외부의 미생물로부터 계란을 보호해주는 역할을 하고, 세균의 염증 반응 동안 lipopolysaccharide(LPS)와 lipoteichoic acid(LTA)와 결합하여 내독소와 비내독소를 중화시키는 역할을 한다(Cordeiro et al.
- 난각 단백질 관련 유전자 발현량 간 상관분석 결과, OCX32, OCX-36, OC-17 및 OC-116 간에 유의한 상관관계가 나타나지 않았다. OCX-32는 자궁 특이적 단백질로 난각의 무기질화 및 외부 각질화에 작용하여 외부 이물질의 침입을 막아주는 역할을 하며, 난각 형성 전 기간에 작용한다(Gautronet al.
- 닭의 30주령과 60주령의 혈중 이온농도 분석 결과, 산란연령에 따라 Ca2+, Na+, K+, Cl－ 이온 농도의 차이는 없는 것으로 나타났다. 이는 사료 급이 형태가 동일할 경우, 연령 증가에 따른 혈중 이온 간의 변화가 없음을 의미한다.
- 1). 더불어 섬모 길이를 측정한 결과, 30주령에 비하여 60주령에 섬모의 길이가 유의적으로 증가하였는데, 이는 30주령의 경우 세포의 활동이 활발하여 재생이 잘 이루어져 섬모의 탈락율도 적고, 섬모의 길이가 짧은 반면, 60주령의 경우 자궁조직의 노화와 손상으로 인해 섬모의 탈락이 많을 뿐만 아니라, 상대적으로 길이가 증가함을 알 수 있다. 닭의 계란형성 기간 동안 난관은 호르몬적, 신경적, 생화학적 세포변화를 겪는 복합 장기로서 난관 구조의 변화는 계란과 난각질에 직접적 영향을 준다(Mohammadpour et al.
- 본 연구에서 추정한 난각 형성 관련 상기 이온 유전자들 발현량 간의 높은 정의 상관은 이러한 이론을 뒷받침하는 결과라 하겠다(Table 4).또한 난각 단백질 관련 유전자 발현량과 난각 형성 이온관련 유전자 발현량들 간의 상관분석결과 OCX-36는 ATP2A2,CALB-1, SCNN1G, CA2, CALM1와 높은 정의 상관을, OCX-32의 경우 ATP2A2, SCNN1G, CA2, CALM1와 높은 정의 상관이 있음을 확인하였다. 이들 간 높은 정의 상관은 상기 난각 단백질 관련 유전자와 이온관련 유전자들이 난각 형성 전 기간 동안 상호 밀접하게 관련되어 작용함을 시사한다.
- 닭의 연령에 따른 혈중 이온농도의 변화를 관찰하고자 30주령과 60주령 개체의 혈중 이온농도를 분석하고 이의 결과를 Table 2에 제시하였다. 분석결과, 혈중 Ca2+ , Na+ , K + , Cl－ 이온 함량은 산란연령에 따른 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 이는 사료 급이 형태가 동일할 경우, 연령 증가에 따른 혈중 이온 간의 변화가 없음을 의미한다. 산란주령에 따른 자궁내막조직 표본의 현미경적 관찰 결과, 30주령에 비하여 60주령에 섬모상피세포의 탈락이 증가하고, 자궁내막세포의 위축과 섬유화 진행양상이 심화됨을 보였다(Fig. 1). 더불어 섬모 길이를 측정한 결과, 30주령에 비하여 60주령에 섬모의 길이가 유의적으로 증가하였는데, 이는 30주령의 경우 세포의 활동이 활발하여 재생이 잘 이루어져 섬모의 탈락율도 적고, 섬모의 길이가 짧은 반면, 60주령의 경우 자궁조직의 노화와 손상으로 인해 섬모의 탈락이 많을 뿐만 아니라, 상대적으로 길이가 증가함을 알 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.