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문제 정의
- 본 연구는 수계 대표종인 Chlorella vulgaris 조류를 이용하여 환경에 노출된 중금속 및 나노입자가 미치는 위해성을 다양한 측정법을 이용하여 비교 분석하였다. 동일한 생물종 생장을 다양한 측정법(흡광도, 클로로필, 개체수)으로 평가하였으며, 측정 방법과 오염물 종류에 따라 상이한 민감도 및 영향이 관찰되었다.
제안 방법
- 개체수 측정은 카운팅챔버(counting chamber)인 유리 기판에 시료를 주입하고 현미경을 통하여 계수하였다. 카운팅챔버는 유리 기판 위에 폭 2 µm의 금속선으로 미세 격자(micro lattice, 50 µm × 50 µm)가 표시되어 있으며 세포 주입을 위해 0.
- 금속별 측정종말점에 따른 조류활성에 미치는 영향을 통합 결과인 TEC50에 근거하여 비교하였다(Table 2). 금속별 측정종말점의 통합 TEC50에 근거한 금속별 독성 순서로는 다음과 같이 조사되었다: Cr (0.
- 나노입자 5종에 대한 민감도(독성)를 두 가지의 측정종말점인 클로로필 함량(대조군 평균 24,010 mg m-3)과 개체수(대조군 평균 2.39 × 107 mL-1) 측정에 근거하여 조사하였다.
- 나노입자별 측정종말점에 따른 조류활성에 미치는 영향을 통합결과인 TEC50에 근거하여 비교하였다(Table 3). 나노입자별 측정종말점에 대한 각 TEC50에 근거한 나노입자별 독성순서로는 다음과 같이 조사되었다: ZnO (2.
- )에 대한 생태독성평가를 수행하였다. 독성평가는 흡광도, 클로로필, 개체수에 대한 측정종말점 측정결과를 비교하고 통합하여 평가하였다.
- 본 연구는 수계 대표종인 Chlorella vulgaris 조류를 이용하여 환경에 노출된 중금속 및 나노입자가 미치는 위해성을 다양한 측정법을 이용하여 비교 분석하였다. 동일한 생물종 생장을 다양한 측정법(흡광도, 클로로필, 개체수)으로 평가하였으며, 측정 방법과 오염물 종류에 따라 상이한 민감도 및 영향이 관찰되었다. 본 연구 결과를 통하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.
- 따라서 본 연구에서는 미세조류인 Chlorella vulgaris를 이용하여 중금속 7종(Cu, Cd, Cr, As(III), As(V), Zn, Ni) 및 나노입자 5종(CuO, ZnO, NiO, TiO2, Fe2O3)에 대한 생태독성평가를 수행하였다. 독성평가는 흡광도, 클로로필, 개체수에 대한 측정종말점 측정결과를 비교하고 통합하여 평가하였다.
- 또한 각 중금속 독성도간의 p-value를 조사하였다. 흡광도와 개체수의 경우 Cr과 Ni, 클로로필과 개체수에서 Cu, Cd의 경우를 제외한 전체의 p-value가 통계적으로 유의(p-value <0.
- 배지는 조류 배양액으로 상용화 되어있는 BG-11 액체배지를 사용하였으며 배지의 조성은 다음과 같다(Table 1). 미세조류를 배양액과 1: 10 (v/v)으로 혼합하여 조류를 충분히 활성화시킨 후(OD730 = 0.6 ~ 0.7) (optical density, 흡광도) BG-11 액체배지로 OD730= 0.3으로 희석하고 오염물을 노출시켜 영향을 관찰하였다. 영향 평가를 위해 활성 조류 19 mL에 오염물 1 mL (총량 20 mL)를 혼합하고, 30 ℃, 150 rpm, 5,000 lux에서 72 h 노출 후 평가하였다.
- 본 실험에서는 시료를 마이크로피펫(pipette)으로 카운팅챔버에 10 µL 주입 후 격자를 보면서 계수하였다.
- 마쇄한 시료를 마개 있는 원심분리관에 넣고 밀봉하여 4 ℃에서 암소 보관한 다음, 20 min 동안 원심분리(500 g)하여 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액은 UV/Vis 분광기를 이용해 630 nm, 645 nm, 663 nm, 750 nm 파장에서 흡광도를 측정한 후 클로로필의 함량은 아래에 근거하여 계산하였다.
- EC50은 오염물이 조류 활성영향에 미치는 영향을 대조군과 비교한 백분율로써 컴퓨터 SPEARMAN 프로그램을 사용하여 추정하였다[13]. 오염물 영향측정은 3회 반복 수행하였다.
- 이 과정에서 밀도(개체수/10 µL)를 계산하여 배양액의 개체수를 측정하였다.
- 조류 활성에 중금속이 미치는 영향은 (1) 흡광도 (2) 클로로필 함량 (3) 개체수에 근거하여 비교하였다. 측정은 UV/Vis 분광기(SHIMADZU 1240 UV Mini, Korea)를 이용하여 730nm 파장에서 측정하였다.
- 중금속 7종에 대한 민감도(독성)를 상이한 측정종말점인 흡광도, 클로로필 함량, 개체수 측정에 근거하여 조사하였다. 중금속을 첨가하지 않은 대조군의 경우 평균 클로로필 함량, 개체수 및 흡광도(OD730)는 24,010 mg m-3, 2.
- 조류 활성에 중금속이 미치는 영향은 (1) 흡광도 (2) 클로로필 함량 (3) 개체수에 근거하여 비교하였다. 측정은 UV/Vis 분광기(SHIMADZU 1240 UV Mini, Korea)를 이용하여 730nm 파장에서 측정하였다. 클로로필 함량 측정은 수질오염공정시험방법을 변형하여 사용하였으며, 개략적 방법은 다음과 같다.
- 측정은 UV/Vis 분광기(SHIMADZU 1240 UV Mini, Korea)를 이용하여 730nm 파장에서 측정하였다. 클로로필 함량 측정은 수질오염공정시험방법을 변형하여 사용하였으며, 개략적 방법은 다음과 같다. 시료 적당량을 유리섬유여지(GF/C, 0.
대상 데이터
- 본 실험에서는 녹조류의 일종인 Chlorella vulgaris를 한국생명연구원(KCTC, No AG10002)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 조류 배양액으로 상용화 되어있는 BG-11 액체배지를 사용하였으며 배지의 조성은 다음과 같다(Table 1). 미세조류를 배양액과 1: 10 (v/v)으로 혼합하여 조류를 충분히 활성화시킨 후(OD730 = 0.
- 본 실험에서는 녹조류의 일종인 Chlorella vulgaris를 한국생명연구원(KCTC, No AG10002)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 조류 배양액으로 상용화 되어있는 BG-11 액체배지를 사용하였으며 배지의 조성은 다음과 같다(Table 1).
- 실험에 사용한 중금속 및 나노입자는 다음과 같다: CuCl2· 2H2O (Yakuri Chemical Co., Ltd., Japan), CdCl2·H2O (Junsei Chemical Co., Ltd., Japan), Na2HAsO2 (Sigma, USA), Na2HAsO4 (Wako, Japan), K2CrO4 (Kanto Chemical Co. Inc., Japan), ZnCl2, NiCl2 (Daejung chemical Co., Ltd., Korea), CuO (30-50 nm), NiO (30 nm), TiO2(30-50 nm), ZnO (40-100 nm) (Alfa Aesar, USA), Fe2O3(20-40 nm) (Nanostructured & Amorphous Materials Inc., USA).
이론/모형
- EPA’s Center for Exposure Assessment Modeling (CEAM)에서 제공하는 Trimmed Spearman Karber method을 이용하여 EC50으로 나타내었다.
성능/효과
- 금속별로는 As 및 Ni은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, Cu, Cr, Cd 및 Zn 등은 낮은 농도에서 저해되어 민감한 것으로 나타났다. Cr의 경우 가장 낮은 EC50을 보여 조사한 중금속 중 가장 높은 독성을 띄는 금속인 것을 알 수 있었다. 금속별 측정종말점에 따른 TEC50을 근거로 한 독성 순서는 Cr > Cu > Cd > Zn > Ni > As(III) >> As(V)순으로 나타났다.
- 나노입자에 대한 독성은 클로로필과 개체수 측정 모두에서 공통적으로 나노입자의 농도가 높을수록 조류 활성이 감소하였다(Figure 3). Fe2O3, TiO2가 가장 낮은 독성을 보였으며 ZnO, NiO, CuO 순으로 높은 독성을 보인다. 나노입자별 일부농도에서의 독성 영향을 살펴보면, ZnO의 경우 3 mg L-1에서 53.
- 중금속에 대한 독성은 측정종말점에 따라 일부 상이하게 조사되었으나, 일반적으로 모든 측정종말점에 대한 독성 영향을 다음과 같이 관찰할 수 있었다 (Figure 1): (1) As(V) (낮은 독성), (2) As(III), Ni (중간 독성), (3) Cr, Cu, Cd, Zn (높은 독성). 금속별 일부 농도에서의 세가지 측정종말점에 대한 독성 영향을 살펴보면, 2 mg Cu L-1에서 46.8 ~ 67.0%, 1 mg Cr L-1에서 64.3 ~ 82.7%, Cd, Zn의 경우 5 mg L-1에서 독성이 각 60.4 ~ 82.4%, 47.6 ~ 90.8%로 조사되었다. 이들에 비해 Ni, As(III)는 상대적으로 낮은 독성을 나타내었으며, 20 mg Ni L-1에서 67.
- 중금속 7종에 대한 독성을 평가한 결과, 금속의 조사 농도 범위에서 농도가 증가할수록 조류의 활성이 저해되었다. 금속별로는 As 및 Ni은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, Cu, Cr, Cd 및 Zn 등은 낮은 농도에서 저해되어 민감한 것으로 나타났다. Cr의 경우 가장 낮은 EC50을 보여 조사한 중금속 중 가장 높은 독성을 띄는 금속인 것을 알 수 있었다.
- 금속별 측정종말점에 따른 TEC50을 근거로 한 독성 순서는 Cr > Cu > Cd > Zn > Ni > As(III) >> As(V)순으로 나타났다. 나노입자 5종에 대한 독성을 평가한 결과, 나노입자의 조사 농도 범위에서 증가할수록 조류의 활성이 저해되는 결과를 나타냈다. 나노입자별로는 TiO2및 Fe2O3은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, CuO, NiO은 낮은 농도에서 반응을 보여 독성이 높은 것으로 나타났다.
- Fe2O3, TiO2가 가장 낮은 독성을 보였으며 ZnO, NiO, CuO 순으로 높은 독성을 보인다. 나노입자별 일부농도에서의 독성 영향을 살펴보면, ZnO의 경우 3 mg L-1에서 53.7 ~ 54.9%로 가장 높은 독성을 보였지만 CuO는 50 mg L-1에서 52.5 ~ 60.0%, NiO는 30 mg L-1에서 54.1 ~ 69.8%의 독성을 나타냈다. TiO2와 Fe2O3는 비교적 낮은 독성을 나타내었으며 90 mg L-1에서 각 56.
- 9 mg L-1)로 조사되었으며, 금속 오염물에 대한 결과와는 상이하게 측정종말점에 따라 유사한 조류생장 억제 영향(독성)을 나타냄을 확인할 수 있었다. 나노입자별 측정종말점에 대한 각 EC50을 보면 CuO, NiO의 경우 개체수에 민감하고, TiO2, ZnO, Fe2O3는 클로로필에 더 민감하다는 것을 알 수 있다. 두 측정종말점에 대한 EC50에 근거하여 나타난 독성 순서는 다음과 같다: ZnO (2.
- 나노입자별 측정종말점에 따른 TEC50 을 근거로 한 독성순서는 ZnO > NiO > CuO > TiO2> Fe2O3순으로, ZnO에 대한 독성 정도가 가장 높은 것으로 나타났다.
- 나노입자 5종에 대한 독성을 평가한 결과, 나노입자의 조사 농도 범위에서 증가할수록 조류의 활성이 저해되는 결과를 나타냈다. 나노입자별로는 TiO2및 Fe2O3은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, CuO, NiO은 낮은 농도에서 반응을 보여 독성이 높은 것으로 나타났다. 특히 ZnO의 경우 가장 낮은 EC50을 보여 본 실험에 이용한 나노입자 중 가장 높은 독성을 띄는 금속인 것을 알 수 있었다.
- 흡광도에 대한 관찰은 나노물질의 색깔이 흡광도에 미치는 영향 때문에 제외하였다. 나노입자에 대한 독성은 클로로필과 개체수 측정 모두에서 공통적으로 나노입자의 농도가 높을수록 조류 활성이 감소하였다(Figure 3). Fe2O3, TiO2가 가장 낮은 독성을 보였으며 ZnO, NiO, CuO 순으로 높은 독성을 보인다.
- 독성이 가장 낮은 금속 As(V) (> 1000 mg L-1)는 독성이 가장 높은 금속인 Cr (0.7± 0.21 mg L-1)과 약 1000배 이상의 독성 차이가 나고, As(III) (17.8 ± 11.13 mg L-1)와는 약 56배 이상의 독성 차이가 나는 것을 알 수 있었다.
- 독성이 가장 높은 나노입자는 ZnO (2.4 ± 0.83 mg L-1), 독성이 가장 낮은 나노입자는 Fe2O3(82.7 ± 8.30 mg L-1)로 이 둘의 독성은 약 34배 이상의 차이가 나는 것을 알 수 있었다.
- 0106). 따라서 금속 오염물 종류 및 측정종말점에 따라 상이한 조류생장 억제 영향(독성)을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 0424)한 것으로 조사되었다. 따라서 본 연구에서 금속별 측정종말점에 따라 독성정도와 민감도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 근거로 하여 오염물이 미칠 수 있는 영향을 평가하기 위해서는 단일방법보다는 다양한 방법들을 사용한 결과를 통합하여 사용하는 것이 적절한 것을 알 수 있었다.
- 나노입자별 측정종말점에 따른 TEC50 을 근거로 한 독성순서는 ZnO > NiO > CuO > TiO2> Fe2O3순으로, ZnO에 대한 독성 정도가 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 오염물에 대해 조류 활성, 즉 세 가지의 측정종말점인 흡광도, 클로로필, 개체수 측정을 사용하여 실험한 결과 일부 오염물(중금속)에 대해서는 측정종말점에 따라 독성 정도와 민감도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 오염물이 미칠 수 있는 영향을 평가하기 위해서 단일 방법 혹은 단일 측정종말점을 이용하기 보다는 다양한 측정종말점의 통합결과에 근거한 접근이 적절할 것이라고 사료된다.
- 또한 씨앗 발아 조사에서 1000 mg L-1 TiO2와 Fe2O3최대조사농도에서 영향이 관찰되지 않았으나, 조류에 대해서는 민감한 결과를 나타내었다. 따라서 씨앗발아가 대체적으로 나노입자에 대해 민감한 영향을 받지만, 나노입자 종류에 따라 조류가 민감한 영향을 받는 것을 알 수 있었다.
- 46 mg L-1에서 50%의 영향 (EC50)을 나타내었다. 또한 씨앗 발아 조사에서 1000 mg L-1 TiO2와 Fe2O3최대조사농도에서 영향이 관찰되지 않았으나, 조류에 대해서는 민감한 결과를 나타내었다. 따라서 씨앗발아가 대체적으로 나노입자에 대해 민감한 영향을 받지만, 나노입자 종류에 따라 조류가 민감한 영향을 받는 것을 알 수 있었다.
- 또한 조류활성에 대한 나노입자 영향 평가 결과는 측정법(클로로필 함량과 개체수)에 따라 통계적으로 차이가 없는 것으로 조사되었다(p-value > 0.05).
- 조사한 금속 중에서 Cr이 가장 높은 독성을 나타내었으며, As(III)와 비교하여 대략 20 ~ 30배 정도 높은 독성을 나타내었다. 또한 측정종말점별 EC50범위는 흡광도 0.9 ~ 30.7 mgL-1, 클로로필 0.5 ~ 10.8 mg L-1, 개체수 0.8 ~ 15.8 mg L-1로 조사되었으며, 클로로필 함량에 대한 민감도가 흡광도보다 높게 조사되었다. 또한 클로로필 함량과 흡광도 간의 통계학적 유의도(차이)인 p(probability) value를 조사한 결과 As(V)를 제외한 모든 중금속에서 p-value가 통계적으로 유의하게 조사되었다(p-value < 0.
- 또한 클로로필 함량과 흡광도 간의 통계학적 유의도(차이)인 p(probability) value를 조사한 결과 As(V)를 제외한 모든 중금속에서 p-value가 통계적으로 유의하게 조사되었다(p-value < 0.0106).
- 8%로 조사되었다. 이들에 비해 Ni, As(III)는 상대적으로 낮은 독성을 나타내었으며, 20 mg Ni L-1에서 67.5 ~ 94.8%, 30 mg As(III)L-1에서 30.1 ~ 80.6%의 독성이 조사되었다. 조사한 다른 금속에 비해 낮은 독성을 보인 As(V)는 측정종말점에 따라 다음 범위의 독성을 나타내었다: 200 mg L-1에서 9.
- 따라서 본 연구에서 금속별 측정종말점에 따라 독성정도와 민감도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 근거로 하여 오염물이 미칠 수 있는 영향을 평가하기 위해서는 단일방법보다는 다양한 방법들을 사용한 결과를 통합하여 사용하는 것이 적절한 것을 알 수 있었다.
- 에 대한 결과를 Figure 2에 나타내었다. 전체적으로 모든 조사 대상 금속에 대해 클로로필 함량(21.6 ~ 91.8% 독성)이 민감한 결과를 나타내었다. 흡광도(15.
- 05 mg L-1로 가장 높은 독성을 보여 조류를 이용한 독성 평가와 매우 상이한 결과를 나타내었다. 조류를 이용한 독성 평가에서 비교적 낮은 독성을 보이는 As(III) (EC50 10.8 ~ 30.7 mg L-1)는 씨앗 발아 1.02 mg L-1, 생물발광 1.10 mg L-1에서 50% 영향(EC50)을 나타내었다. 씨앗 발아에서 As(V)의 경우 EC50이 3.
- 0 mgL-1. 조사한 금속 중에서 Cr이 가장 높은 독성을 나타내었으며, As(III)와 비교하여 대략 20 ~ 30배 정도 높은 독성을 나타내었다. 또한 측정종말점별 EC50범위는 흡광도 0.
- 본 연구 결과를 통하여 다음과 같은 결론을 도출하였다. 중금속 7종에 대한 독성을 평가한 결과, 금속의 조사 농도 범위에서 농도가 증가할수록 조류의 활성이 저해되었다. 금속별로는 As 및 Ni은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, Cu, Cr, Cd 및 Zn 등은 낮은 농도에서 저해되어 민감한 것으로 나타났다.
- 측정종말점별 나노입자에 대한 EC50범위는 클로로필(2.6 ~ 89.5 mg L-1), 개체수(2.1 ~ 75.9 mg L-1)로 조사되었으며, 금속 오염물에 대한 결과와는 상이하게 측정종말점에 따라 유사한 조류생장 억제 영향(독성)을 나타냄을 확인할 수 있었다. 나노입자별 측정종말점에 대한 각 EC50을 보면 CuO, NiO의 경우 개체수에 민감하고, TiO2, ZnO, Fe2O3는 클로로필에 더 민감하다는 것을 알 수 있다.
- 나노입자별로는 TiO2및 Fe2O3은 상대적으로 고농도에서 활성 저해가 나타난 반면, CuO, NiO은 낮은 농도에서 반응을 보여 독성이 높은 것으로 나타났다. 특히 ZnO의 경우 가장 낮은 EC50을 보여 본 실험에 이용한 나노입자 중 가장 높은 독성을 띄는 금속인 것을 알 수 있었다. 나노입자별 측정종말점에 따른 TEC50 을 근거로 한 독성순서는 ZnO > NiO > CuO > TiO2> Fe2O3순으로, ZnO에 대한 독성 정도가 가장 높은 것으로 나타났다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서는 오염물에 대해 조류 활성, 즉 세 가지의 측정종말점인 흡광도, 클로로필, 개체수 측정을 사용하여 실험한 결과 일부 오염물(중금속)에 대해서는 측정종말점에 따라 독성 정도와 민감도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 오염물이 미칠 수 있는 영향을 평가하기 위해서 단일 방법 혹은 단일 측정종말점을 이용하기 보다는 다양한 측정종말점의 통합결과에 근거한 접근이 적절할 것이라고 사료된다.
- 환경 생물검정법을 이용한 오염물의 위해 정도 평가 및 결과 해석에서 일반적으로 생물종 및 측정종말점에 따라 오염물에 대한 상이한 민감도를 보인다[11]. 따라서 단일방법에 의한 평가보다는 다양한 방법에 근거한 오염물 독성 평가 접근법이 필요하며, 생물종에 따라 상이한 민감도에 의한 생물검정법 결과의 통합은 오염물 혹은 오염 환경의 모니터링에 더욱 적절한 정보를 제공해 줄 것이다[12].
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