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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내에서 재배되고 있는 삼채에 대한 용매별(에탄올, 열수), 부위별(잎, 뿌리, 전체)로 나누어 생쥐의 해마유래 세포주인 HT22세포를 이용하여 HO-1 발현에 대한 뇌세포 보호효과를 살펴보고자 하였다
제안 방법
- HO-1 발현을 증가 시킨 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 Nrf2 핵 내 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해, 삼채 뿌리 에탄올 추출물 (400 μg/mL)처리하여 시간별로 측정하였다(Fig. 3) 시간이 경과함에 따라 Nrf2가 핵 내로 전사 되면서(Fig. 3A) cytosol 의 Nrf2가 현저히 줄어드는 반면, (Fig. 3B) nuclear의 Nrf2가 증가하는 양상을 보여, Nrf2의 핵 내로의 전사가 이루어 졌음을 확인 할 수 있었으며, HO-1 단백질의 발현에 대한 메커니즘 중 가장 직접적인 관련이 있는 것으로 알려진 nuclear factor-E2-related factor 2(Nrf2)의 핵 내 전사를 통하여 HO-1 단백질의 발현을 조절하는 것을 실험을 통하여 다시 한번 확인하였다.
- HT22세포를 96 well microplate에 1×104 cells/ well이 되게 분주한 후, 37°C의 5% CO2 incubator에서 12시간 배양한 다음, 5 mM의 글루타메이트와 각 추출물과 분획물(100, 200, 400 μg/ml)을 농도별로 처리하였다.
- 이러한 원리를 이용하여 ROS생성 정도를 측정하였다. ROS 소거작용과 HO-1 발현 간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO activity inhibitor로 알려진 Tin protoporphyrin (SnPP)를 처리하여 세포생존율 실험을 진행하였다(Fig. 4).
- ROS(Reactive Oxygen Species) 측정 − 배양된 세포를 PBS로 세척한 후, 10 μM 2',7'-dichlofluorescein diacetate (DCFDA, 35845)를 포함하는 Hank' balanced salt 용액에서 30분 동안 암실에서 반응시킨 후 세포의 형광광도(excitation wave length: 490 nm; emission wave length: 525 nm)를 microplate reader(SpectramaxGemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)로 측정하였다.
- Western Blot Analysis − HT22 세포를 60 mm dish에 2×105cells/well 농도로 12시간 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다.
- 글루타메이트로 유발한 세포 독성에 대한 삼채 추출물의 뇌세포 보호활성 효과를 알아보기 위해 독성이 검출되지 않은 400 μg/mL 이하로 실험 농도를 정하였다.
- 글루타메이트로 유발한 세포독성에 대한 뇌세포 보호효과 − 용매(에탄올, 열수)에 따른 삼채 추출물 잎(A.H L), 뿌리(A.H R), 그리고 전체(A.H L+R)에 대한 HT22 세포의 생존율에 미친 영향을 알아보고자 농도별(100, 200, 및 400 µg/ mL)로 세포에 처리하여 생존율을 측정하였다(Fig. S1).
- 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 DMSO에 녹인 시료를 다양한 농도(100, 200, 400 µg/mL)로 DMEM 배지에 희석하여 첨가하였다.
- HT22 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4°C, 16,000 rpm 에서 15분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 Nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사 하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.
- 모든 실험은 대조군에 대한 세포 보효율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
- 본 실험에서는 국내산 삼채 부위별(잎, 뿌리, 전체)과 용매별(에탄올, 열수)로 그 분획물이 갖는 뇌세포 보호효과를 측정하였다. 삼채는 동결 건조한 잎과 뿌리, 전체 분말을 각각 10 g 씩 500 mL 2시간동안 가열 환류추출 하였고, 여과한 다음 여액을 다시 감압 농축하여 제조하였다.
- 삼채 잎(A.H L), 뿌리(A.H R), 그리고 전체(A.H L+R) 추출물(물과 에탄올)이 세포독성을 나타내지 않은 100, 200, 및 400 µg/mL농도에서 실험을 진행하였으며, 뇌세포 보호 효과를 측정하고자 글루타메이트를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 생쥐의 해마 유래 HT22 세포의 생존율과 뇌세포 보호 효과를 검색하였다.
- 시료 처리 12시간 후 세포 생존율을 MTT 방법으로 측정하였으며, Trolox 50 μM을 양성 대조군으로 하여 비교하였다.
- 시료의 제조 − 삼채 잎(A.H L EtOH)과 뿌리 동결건조 분말(A.H R EtOH)을 각각 10 g씩 500 mL 증류수와 500 mL 99% 에탄올을 사용하여 2시간 동안 가열 환류추출(HEATING MANTLE, MS-EAM920400, Seoul, Korea)하였고, 여과 (No. 2, Whatman, Maidstone, England)한 다음 여액을 감압 농축(EYELA Digital water bath, SB-1000, Tokyo, Japan) 하여 -20°C에 보관하며 실험에 사용하였다.
- ROS 생성 억제 효과 − 세포 내에서 활성산소가 발생되면 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFDA)가 esterase또는 산화적 가수분해에 DCFH로 탈아세틸화 되고 비형광성인 DCFH는 활성 산소에 의해 산화되어 2',7'-dichlorofluorescein(DCF)로 전환되고 이는 강한 형광물질을 가진다. 이러한 원리를 이용하여 ROS생성 정도를 측정하였다. ROS 소거작용과 HO-1 발현 간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO activity inhibitor로 알려진 Tin protoporphyrin (SnPP)를 처리하여 세포생존율 실험을 진행하였다(Fig.
- 96-well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories, Philadelphia, PA) 를 이용하여 측정하였다. 모든 시약은 Sigma사(St, Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
대상 데이터
- 96-well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories, Philadelphia, PA) 를 이용하여 측정하였다.
- L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
- 뇌세포 보호 효과 실험의 유의성 확인을 위한 양성 대조약물로는 항산화 물질로 알려진 trolox(50 μM)을 사용하였다.
- 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories, Philadelphia, PA) 를 이용하여 측정하였다. 모든 시약은 Sigma사(St, Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 세포배양 및 뇌 세포 보호활성 측정 − 마우스 해마유래 HT22 세포주는 묵인희 교수(Seoul National University, Seoul, Korea)로부터 분양 받아 사용하였으며, DMEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가하여 37°C의 5% CO2 incubator에서 1-2일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 시약 및 기기 − DMEM 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone Laboratories사에서 구입하였다.
- 실험재료 − 본 연구에서 사용된 삼채는 강원도 대관령 삼채농장(Gangwon-do, Korea)에서 11월에 재배 생산된 삼채를 구입하여 사용하였으며, 경기대학교 대체의학대학원 김애정 박사에 의한 형태학적 평가를 통하여 동정하였다.
데이터처리
- , San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.
- 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.05)에서 유의성 검정을 실시하였다.
- 각 well에 형성된 formazan 에 DMSO 150 µl를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 녹이고, 30분 후 540 nm에서 흡광도(BioRad, Hercules, CA, USA)를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값을 구하였으며, Control의 흡광도 값을 기준으로 생존율을 비교하였다. HT22세포를 96 well microplate에 1×104 cells/ well이 되게 분주한 후, 37°C의 5% CO2 incubator에서 12시간 배양한 다음, 5 mM의 글루타메이트와 각 추출물과 분획물(100, 200, 400 μg/ml)을 농도별로 처리하였다.
- 통계 처리 − 본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하였다.
이론/모형
- 글루타메이트로 유도한 뇌세포 독성에 대한 보호 효과는 Jeong 등의 방법26)에 따라 실시하였다. 종양세포를 3×104 cells/ mL의 농도가 되도록 조절한 후 96 well plate에 1×104 cell/ well로 동일하게 분주하고 12시간 동안 배양하였다.
- 4), 50mM glycerophosphate, 20 mM NaF, 20 mM ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA), 1 mM dithiothreitol(DTT), 1 mM Na3VO4, protease inhibitors]를 첨가하고 40°C에서 15분간 혼합한 후 4°C, 16,000×g에서 15분간 원심분리한다. 이후의 과정은 상술된 western blotting 방법을 이용하였다.
성능/효과
- 14) 양파(Allium cepa L), 부추(Allium tuberosum), 마늘(Allium sativum) 등은 대표적인 Allium속 식물들인데, 이 들 Allium 속 식물은 향신료로 수세기 동안 사용되어져 왔으며 현재 까지도 널리 활용되고 있다.15) 특히 Allium속 식물이 함유하고 있는 유황화합물은 살균력이 강해 염증반응을 감소시켜 아토피, 건선 및 무좀 등과 같은 피부질환에 효과가 뛰어나다고 알려져 있다.
- 7 세포에서 삼채 뿌리 에탄올추출물 500 μg/ mL 농도 처리 시 1시간 내 항염증에 관여하는 HO-1 발현이 나타났다고 보고한 바 있다.21) 본 연구에서는 Bae 등의 결과와는 다르게 생쥐 해마세포에서 뇌세포 보호에 관여하는 HO-1의 발현이 나타나는 것을 확인하였다. HO-1 발현을 증가 시킨 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 Nrf2 핵 내 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해, 삼채 뿌리 에탄올 추출물 (400 μg/mL)처리하여 시간별로 측정하였다(Fig.
- 4) 그러나 과도하게 생성된 활성 산소종은 정상 세포의 사멸, DNA 변성, 단백질 분해, 지질 산화 등을 초래하여 노화, 심혈관계 질환 및 암질환 발생의 주범이다.5)
- 그 결과 삼채 추출물 에탄올 용매뿌리 400 μg/mL에서는 81.3%에서 가장 높은 보호효과를 보였다.
- 시간대 별로 관찰한 결과 3시간까지는 반응을 보이지 않았으며, 6시간 이후부터 점차 반응을 나타내기 시작했다. 그 후 18시간에서 가장 높은 발현을 보였으며 24시간이 되었을 때는 발현의 정도가 약간 감소하였다(Fig. 2B). 24시간 에서 HO-1의 발현이 약간 감소하는 경향이 나타나는 이유로, 일반적으로 단백질의 발현은 자극에 의해 발현이 증가 되다가 정점에 이른 후 회복 단계에 이르러 발현이 감소하는 형태를 나타내는데, HO-1의 발현 또한 정점에 이르는 시간은 세포의 종류나 상태에 따라 차이가 나타나게 된다.
- 뇌 세포 보호활성 효과가 가장 높은 삼채 추출물 뿌리부 위의 Nrf2의 핵 내 전사 유도를 통하여 HO-1 단백질을 발현함으로써 뇌세포보호활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 24시간 에서 HO-1의 발현이 약간 감소하는 경향이 나타나는 이유로, 일반적으로 단백질의 발현은 자극에 의해 발현이 증가 되다가 정점에 이른 후 회복 단계에 이르러 발현이 감소하는 형태를 나타내는데, HO-1의 발현 또한 정점에 이르는 시간은 세포의 종류나 상태에 따라 차이가 나타나게 된다. 따라서 우리의 결과와 같이 24시간에 이르기 전에 HO-1의 발현량이 정점에 이른 후 감소하는 경우도 있고, 24시간 이후 까지 유지되는 경우도 나타난다.29-31) Bae 등은 생쥐 대식세 포주인 RAW264.
- 본 연구 결과 삼채 뿌리가 잎에 비해 뇌세포 보호효과에 더 효과적으로 작용한 결과는 유황 함유량이 잎보다 뿌리에 더 높게 나타났기 때문이라고 사료된다. 추후 삼채 부위 별 유황의 함유량에 따른 뇌세포 보호효과에 대한 실험이 좀 더 필요하다 생각된다.
- 본 연구결과 HT22 세포에 처리된 삼채 잎과 뿌리, 전체 추출물은 400 µg/mL 이하의 농도에서 거의 100%의 생존율을 보여 잎과 뿌리 모두 세포에 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 산화적 스트레스로부터의 뇌세포 보호 기전에 있어 중요한 단백질인 Heme oxygenase-1(HO-1)의 발현 정도를 알아보기 위해 뇌세포 보호 효과 결과에서 가장 높은 보호률을 나타낸 삼채 뿌리 에탄올 추출물을 이용하여 실험한 결과 농도 의존적으로 HO-1 단백질 발현을 증가시킨 것을 확인하였다(Fig. 2A).
- 삼채 뿌리 에탄올추출물(A.H L EtOH) 400 μg/mL 농도 처리 시 81.3%의 생존율로 보호 효과가 가장 높았으며, 삼채 뿌리 에탄올 추출물 200 μg/mL에서 68.5%, 증류수 용매 뿌리 400 μg/mL에서는 45.3%로 용매별, 부위별 다른 세포 생존율을 나타내었으며, 비교 결과 증류수 용매보다 에탄올 용매에서 높은 보호효과를 나타내었다.
- 삼채의 뇌세포 보호효과와 ROS 소거 작용과 HO-1의 발현간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO activity inhibitor로 알려진 Tin protoporphyrin(SnPP)를 처리하여 세 포생존율 실험을 진행한 결과, HO activity 억제제인 SnPP를 3시간 전처리 후 삼채 뿌리 에탄올 추출물(A.H R EtOH) 과 함께 glutamtate 5mM 처리 시 농도별로 증가하였던 세포 생존율과 ROS 소거 작용이 SnPP에 의해 역전된 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 삼채의 ROS 생성 억제 능이 HO-1 단백질 발현과 관련 있음을 확인하였으며, 뇌세포 보호활성에 기여함을 보여주었다.
- 뇌세포 보호 효과 실험의 유의성 확인을 위한 양성 대조약물로는 항산화 물질로 알려진 trolox(50 μM)을 사용하였다. 실험 결과, 처리 농도가 증가함에 따라서 세포 생존율 농도도 의존적으로 증가한 것을 확인하였다(Fig. 1).
- H R EtOH) 과 함께 glutamtate 5mM 처리 시 농도별로 증가하였던 세포 생존율과 ROS 소거 작용이 SnPP에 의해 역전된 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 삼채의 ROS 생성 억제 능이 HO-1 단백질 발현과 관련 있음을 확인하였으며, 뇌세포 보호활성에 기여함을 보여주었다.
후속연구
- 또한, 삼채의 효능이 잎에 비해서 뿌리에서 더 우수한 효과가 나타났는데 이를 확인하기 위해서는 HPLC profile 등의 분석이 필요할 것으로 보인다. 그리고 Allium속 의 대표적인 화합물인 유황 유래 화합물과의 비교 분석을 통해 추후 뇌세포 보호기전 연구와 활성 물질 분리, 구조규명 및 동물실험 등에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 현대 의학의 발달로 수명이 길어진 지금 가장 두려워하는 질병 중 하나인 치매, 알츠하이머 등과 같은 뇌질환을 꼽고 있는 현실에 맞춰 볼 때 이번 연구에서 사용된 삼채는 앞으로 뇌 질환 관련 증상들의 완화와 예방식품으로서 역할 가능성이 높아 보이며, 이에 관한 연구는 계속되어야 한다고 사료된다. 또한, 삼채의 효능이 잎에 비해서 뿌리에서 더 우수한 효과가 나타났는데 이를 확인하기 위해서는 HPLC profile 등의 분석이 필요할 것으로 보인다. 그리고 Allium속 의 대표적인 화합물인 유황 유래 화합물과의 비교 분석을 통해 추후 뇌세포 보호기전 연구와 활성 물질 분리, 구조규명 및 동물실험 등에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구 결과 삼채 뿌리가 잎에 비해 뇌세포 보호효과에 더 효과적으로 작용한 결과는 유황 함유량이 잎보다 뿌리에 더 높게 나타났기 때문이라고 사료된다. 추후 삼채 부위 별 유황의 함유량에 따른 뇌세포 보호효과에 대한 실험이 좀 더 필요하다 생각된다.
- 현대 의학의 발달로 수명이 길어진 지금 가장 두려워하는 질병 중 하나인 치매, 알츠하이머 등과 같은 뇌질환을 꼽고 있는 현실에 맞춰 볼 때 이번 연구에서 사용된 삼채는 앞으로 뇌 질환 관련 증상들의 완화와 예방식품으로서 역할 가능성이 높아 보이며, 이에 관한 연구는 계속되어야 한다고 사료된다. 또한, 삼채의 효능이 잎에 비해서 뿌리에서 더 우수한 효과가 나타났는데 이를 확인하기 위해서는 HPLC profile 등의 분석이 필요할 것으로 보인다.
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