[논문]갈대이삭으로부터 Tricin의 분리 및 함량 분석

우현심; 이승영; 황병수; 정상철; 김대욱

[국내논문] 갈대이삭으로부터 Tricin의 분리 및 함량 분석
Isolation and Quantitative Analysis of Tricin from Ears of Phragmites communis 원문보기

생약학회지, v.48 no.1, 2017년, pp.77 - 81

우현심 (국립경상대학교 응용생명과학부) , 이승영 (국립낙동강생물자원관 담수생물특성연구실) , 황병수 (국립낙동강생물자원관 담수생물특성연구실) , 정상철 (국립낙동강생물자원관 담수생물특성연구실) , 김대욱 (국립낙동강생물자원관 담수생물특성연구실)

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to investigate a validation method for determination of tricin in Phragmites communis ears. Tricin was isolated with chromatographic methods and used as the standard substances for quantitative analysis. The structural determination was characterized by comparing their NMR spectral data with values reported in the literature. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, detection limits, and quantification limits of tricin was measured by HPLC. The results show that the specificity was satisfied with retention time and diode array detector (DAD) spectrum by analysis of tricin using HPLC. The limits of detection (LOD) for tricin was 0.84 mg/ml. Recovery of tricin was 98.80~108.22% with R.S.D values less than 2%. Intra-day and inter-day precisions of tricin in P. communis ears were 99.96~100.96% and 99.01~100.40%, respectively. Therefore, application of tricin was validated by an analytical method as major compound in P. communis ears.

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AI 본문요약
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제안 방법

^12,13) 갈대의지하부에 대한 성분 및 활성 연구는 활발히 진행되었으나 지상부에 대한 연구가 제대로 되어 있지 않은 실정이다. 이에 본 연구는 갈대 지상부에 속하는 갈대이삭을 메탄올로 추출하여 각종 column chromatography법을 이용하여 주요성분 tricin을 분리한 후, 분광학적인 방법으로 분자구조를 규명하였다. 또한 갈대이삭의 추출용매별 tricin 함량 및 확인시험을 HPLC-DAD 방법으로 확립하였다.
이에 본 연구는 갈대 지상부에 속하는 갈대이삭을 메탄올로 추출하여 각종 column chromatography법을 이용하여 주요성분 tricin을 분리한 후, 분광학적인 방법으로 분자구조를 규명하였다. 또한 갈대이삭의 추출용매별 tricin 함량 및 확인시험을 HPLC-DAD 방법으로 확립하였다.
HPLC 분석에서 칼럼은ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×150 mm, 5 μm, Agilent,USA)을 사용하였고, HPLC 장비는 pump, auto sample,column oven, DAD(Agilent 1260 infinity HPLC system,Agilent Technologies, USA)를 사용하여, 데이터 수집 및 처리를 위해 open lab software program을 사용하였다.
ODS gel이 충진되어 있는 30×460 mm glass column에 분획물을 100 mg/ml의 농도로 조제하여 5 ml 주입하고 water-acetonitrile 혼합용매(100:1, 70:30, 50:50,20:80, 0:100)의 조건으로 분당 35 ml씩 용출시켜 분리하였다.
추출 및 분획 − 갈대이삭 420 g을 10 L 삼각 플라스크에 methanol(5 L) 넣고, 실온에서 5일간 빛을 차단하여 방치하였다.
HPLC는 Agilent사의 1260 infinity 기기를 통하여 측정하였고, column은 Agilent사의 ZORBAX Eclipse plus C18(4.6mm×150 mm, 5 μm-particle size)를 이용하였다.
5715, Merck)를 사용하였으며,UV의 검색은 254와 365 nm에 측정하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker-AM spectrometer(500 MHz for ¹H and 125 MHz for ¹³C)기기로 DMSO-d6 용매를 이용하여 측정하였다. HPLC는 Agilent사의 1260 infinity 기기를 통하여 측정하였고, column은 Agilent사의 ZORBAX Eclipse plus C18(4.
ODS gel이 충진되어 있는 30×460 mm glass column에 분획물을 100 mg/ml의 농도로 조제하여 5 ml 주입하고 water-acetonitrile 혼합용매(100:1, 70:30, 50:50,20:80, 0:100)의 조건으로 분당 35 ml씩 용출시켜 분리하였다. MPLC상에서 순차적으로 분리된 5개의 1차 분획층들(Fr1-5) 중 지표성분 분획으로 확인된 Fr-4(240 mg)를 두 차례 Sephadex LH-20(GE Healthcare Life Sciences) column chromatography를 80% MeOH 용매 조건으로 화합물 1(43mg)을 얻었다.
제조된 표준용액은 4oC에서 냉장 보관하였다. Tricin의 함량을 구하기 위하여 표준용액의 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 농도별 면적에 대하여 검량선을 작성하였다.
1% formic acid가 첨가된 acetonitrile을 사용하였으며 모든 용매는 사용 전 탈기 및 필터로 여과 후 사용하였다. 칼럼의 유속은 1.0 ml/min이었으며 분석 시간은 0에서 6분까지 이동상 A를 95%로 용리하였고, 6분에서 30분까지 이동상을 B를 70%가 되도록 한 다음, 30분에서 35분까지 이동상B를 70%로 유지하고, 35분에서 45분까지 이동상 B를 100%가 되도록 한 다음 45분에서 50분까지 이동상 B를 100%로 유지하면서 분석을 실시 하였다. 이후 50분까지 이동상 A를 95%로 내려 초기 용매 조건으로 조정하였다.
분석 방법의 검증(Validation) − HPLC 분석법의 재현성 및 정확도를 검증하기 위해 ICH(International conference on Harmonization)의 가이드라인에 기초하여 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection) 및 정량한계(LOQ, limit of quantitation) 측정, 반복실험을 통한 정밀성(precision) 평가, 회수율(recovery) 시험을 통한 정확성(accuracy) 평가를 실시하였다.
검량선 및 검출한계, 정량한계 조사 − Tricin 표준용액 3.12, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 100, 200 μl/ml로 단계적으로 희석하여 HPLC로 분석하여 검량선을 작성하였으며 Fig. 3과 같은 검량선을 나타내었다.
45 µm syringe filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 각 시료는 세 번씩 반복 분석하였다. 표준용액의 chromatogram의 피크 면적을 통하여 작성된 검량선에 의해 갈대이삭 추출물 시료 중 tricin의 함량을 산출하였다.
각 시료는 세 번씩 반복 분석하였다. 표준용액의 chromatogram의 피크 면적을 통하여 작성된 검량선에 의해 갈대이삭 추출물 시료 중 tricin의 함량을 산출하였다.
추출용매별 함량분석(Content) − 확립된 분석법을 이용하여 갈대이삭 추출용매별(Water, 50% MeOH, MeOH,EtOH, acetonitrile) tricin 함량을 분석하였다.
정밀성 검토 − 정밀성은 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에서 분석하였을 때 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하는 것으로 정밀성을 분석하였다.
갈대이삭의 MeOH 추출물로부터 각종 컬럼 chromatography법을 이용하여 지표성분을 분리, 분광학적 방법을 통해 tricin으로 구조 동정하였다. 분석법 검증 결과는 HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 retention time과 갈대이삭 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다.
회수율 측정 − 회수율은 tricin이 함유되어 있지 않은 공시료에 표준용액 50.0, 66.6, 100 µg/ml의 세 가지 농도를 첨가하고 앞의 전처리법에 의해 처리한 뒤 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하였다.

대상 데이터

화합물 분리에 사용한 기기는 YMC사의 Multiple Preparative HPLC LC-Forte/R chromatography system를 사용하였고 충진제는 YMC gelODS-A(15 μm)를 사용하였다.
식물재료 − 본 실험에 사용된 갈대이삭은 2016년 경북 상주시 낙동보 주변에서 채취 후 음건하여 사용하였으며, 국립낙동강생물자원관 박진희박사가 동정하였다.
Thin layer chromatography용 plate는 precoated silica gel 60 F254plate(layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm. Art. 5715, Merck)를 사용하였으며,UV의 검색은 254와 365 nm에 측정하였다.

성능/효과

게다가 대나무, 야자나무, 사탕수수에서도 분리되었고, 초목의 종자, 열매에서도 보고된다.^7,8) 대나무 및 귀리껍질 에탄올 추출물에서 분리된 tricin화합물은 혈액순환 개선효과 및 항염증 효과, 중성지방의 축적을 69% 억제하여 지방 세포 분화를 억제하는 항비만에 효과가 있다.^9,10)
를 분무하고 가열시 노란색으로 나타났으며 flavonoid계 화합물로 추정되었다. 이 화합물의 EIMSspectrum에서는 m/z 330에서 [M]⁺에 molecular ion peak를 확인하였고, HREIMS spectrum에서 m/z 330.0740의 [M]⁺는 분자식 C₁₇H₁₄O₇의 [M⁺] 계산값 330.0740과 일치했다. ¹H-NMR spectrum에서 δ 6.
특이성 확인 − 특이성은 불순물, 분해물, 추출물 등이 혼합된 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 의미하며 다른 물질의 간섭 없이 분리될 수 있는 것으로 특이성을 확인하게 된다. 표준용액과 갈대 이삭 추출한 용액의 chromatogram을 비교하여 tricin peak를 확인한 결과 Fig. 2와 같이 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며 표준용액의 retention time(t_R)과 추출물의 RT 값이 일치하였으며 표준용액과 갈대이삭 추출물의 DAD spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig. 2).
Table III에 나타나 바와 같이tricin의 회수율은 50.0 µg/ml에서는 99.67~101.45%, 66.6 µg/ml는 106.94~109.17%, 그리고 100 µg/ml의 농도에서는97.76~99.56%의 범위의 회수율을 보였으며, 분석오차 10%이내를 만족하였다.
추출용매별 함량분석(Content) − 확립된 분석법을 이용하여 갈대이삭 추출용매별(Water, 50% MeOH, MeOH,EtOH, acetonitrile) tricin 함량을 분석하였다. 추출용매에 따른 지표성분 함량 지표는 Table V와 같이 100% MeOH 추출에서 가장 높은 효율을 확인하였고, water에서는 tricin이 추출되지 않는 것으로 확인하였다.
갈대이삭의 MeOH 추출물로부터 각종 컬럼 chromatography법을 이용하여 지표성분을 분리, 분광학적 방법을 통해 tricin으로 구조 동정하였다. 분석법 검증 결과는 HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 retention time과 갈대이삭 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Tricin의 검량성은상관계수 값이 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다.
분석법 검증 결과는 HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 retention time과 갈대이삭 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Tricin의 검량성은상관계수 값이 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Tricin의 검출한계는 0.
53 µg/ml로 나타났다. 정밀도 측정 결과tricin은 intra-day에서 99.96~100.96%의 정밀도를 보여주었으며 inter-day에서는 99.01~100.96%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 tricin은 98.
96%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 tricin은 98.80~108.22% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 추출용매별tricin의 함량을 확인한 결과 MeOH, EtOH, 50% MeOH,acetonitrile 순으로 관찰되었다.
22% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 추출용매별tricin의 함량을 확인한 결과 MeOH, EtOH, 50% MeOH,acetonitrile 순으로 관찰되었다. 본 연구 결과 갈대이삭의 주요성분 tricin의 HPLC를 이용한 분석방법이 적합한 분석방법임을 검증되었다.
추출용매별tricin의 함량을 확인한 결과 MeOH, EtOH, 50% MeOH,acetonitrile 순으로 관찰되었다. 본 연구 결과 갈대이삭의 주요성분 tricin의 HPLC를 이용한 분석방법이 적합한 분석방법임을 검증되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Tricin은 구조적으로 어떻게 구성되는가?	Tricin(5,7,4′-trihydroxy-3′,5′-dimethoxyflavone)1)은 flavonoid의 일종으로, 구조적으로 두 개의 phenyl rigngs(benzoyl system, cinnamoyl system)과 하나의 heterocyclic ring2)으로 구성되어 있다. Tricin은 독성이 낮고, 항산화, 항박테리아, 항균, 살충작용, 항암, 항알러지, 항 HIV, 항염증등 다양한 생리활성이 보고되어 tricin에 대한 관심이 증가하고 있다.
	갈대의 특징은 무엇인가?	갈대(Phargmites communis)는 화본과(Gramineae)의 다년생 초본으로 봄에서 가을 사이에 채취하여 수염뿌리를 제거하고 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하며, 부위에 따라 뿌리줄기를 노근, 줄기를 노경, 잎을 노엽, 꽃을 노화라고 하며 한방에서 진토, 소염, 이뇨 해열, 해독에 사용하였다.11)노근 추출물의 기억력 회복효과 및 세포 보호효능등과 같은 생리활성 연구와 주요활성성분으로 b-sitosterol, p-coumaricacid, vanilic acid, methyl gallate등 보고되었다.
	tricin 화합물은 어떤 나무들에서 분리되는가?	3-6)대부분의 tricin 화합물은 화본과(Gramineae) 식물인 밀, 쌀, 보리등의 껍질에서 분리되었다. 게다가 대나무, 야자나무, 사탕수수에서도 분리되었고, 초목의 종자, 열매에서도 보고된다.7,8) 대나무 및 귀리껍질 에탄올 추출물에서 분리된 tricin화합물은 혈액순환 개선효과 및 항염증 효과, 중성지방의 축적을 69% 억제하여 지방 세포 분화를 억제하는 항비만에 효과가 있다.

참고문헌 (14)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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