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문제 정의
- 지질산화 초기에 발생되는 과산화물은 ferrous chloride와 반응하여 빨간색에 가까운 ferric chloride 색소를 생성하게 되며, 지질산화가 계속 진행되면 malonaldehyde와 같은 저분자의 화합물이 생성되는데 이것은 TBA와 결합하여 빨간색의 화합물을 형성한다(33). 따라서 본 실험에서는 불포화지방산인 linoleic acid를 기질로 하여 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 산화방지 효과를 평가하였다.
- 따라서 본 연구에서는 다양한 효소원을 이용하여 갈색거저리 유충으로부터 생리활성 펩타이드를 함유하는 단백가수분해물을 제조하였으며, 그중 가수분해도가 우수한 것을 선택하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 및 hydrogen peroxide(H2O2) 소거 활성과 지질과산화 억제 활성을 측정하여 분리된 단백가수분해물의 항산화 활성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 10 mM sodium bicarbonate(pH 8.5) 990 μL와 1% TNBS 10 μL를 혼합(v/v)하여 0.01% TNBS를 제조하고, TNBS 50 μL와 시간별로 취한 반응혼합액 100 μL를 섞어 37°C에서 2시간 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해 10% SDS와 1 N hydrogen chloride(1 N HCl)를 첨가시켰다.
- Alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소별로 갈색거저리 유충 단백가수분해물을 제조하여 그 특성을 조사하였다. 24시간 반응시킨 각 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 특성을 확인하고자 SDS-PAGE를 실시하여 alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소에 대한 단백가수분해물의 SDS-PAGE 패턴을 Fig. 1에 나타내었다. 효소별 단백가수분해물을 비효소군과 비교한 결과, 비효소군보다 alcalase 단백가수분해물이 10 kDa 이하로 모두 분해되어 10 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않았으며, 저분자 펩타이드가 많고 가수분해도가 우수함을 확인하였다.
- ABTS 라디칼 소거 활성 실험은 Re 등(24)의 방법을 변형하여 측정하였다. 최종 농도가 7 mM인 ABTS와 2.
- Alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소별로 갈색거저리 유충 단백가수분해물을 제조하여 그 특성을 조사하였다. 24시간 반응시킨 각 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 특성을 확인하고자 SDS-PAGE를 실시하여 alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소에 대한 단백가수분해물의 SDS-PAGE 패턴을 Fig.
- DPPH free 라디칼 소거 활성은 Ham 등(23)의 방법에 따라 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올을 이용하여 시료를 0, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL로 희석하고 희석된 시료를 96 well plate에 160 μL씩 분주하였다.
- Linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 확인하기 위해 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 2 mL와 2.52% linoleic acid 1 mL, absolute alcohol 1 mL, 시료 1 mL를 혼합한 후 40°C에서 100 rpm으로 진탕하며 하루 간격으로 각 시료의 linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 측정하였다.
- TNBS assay를 이용해 각 단백가수분해물의 가수분해도를 그 지표로 사용되는 available amino group의 농도로 측정하였다. 단백질이 가수분해되면 가수분해도에 비례하여 available amino group이 증가하므로 이는 펩타이드의 함량을 나타내는 지표가 될 수 있다.
- 단백질 가수분해물의 경우 저분자량 펩타이드가 쉽게 체내로 흡수되고 체내 이용률도 높다는 보고(22)에 따라 가수분해가 활발히 일어났던 alcalase, flavourzyme, neutrase 가수분해물을 분자량 3 kDa 이하로 한외여과 한 후 동결 건조하여 실험에 이용하였다. 각 단백가수분해물의 저분자 펩타이드 생산 효율을 비교하기 위해 전체 기질의 고형분 함량에 대하여 3 kDa 이하로 분리한 후의 펩타이드의 무게를 측정하였으며 그 수율을 비교하였다(Table 1). Alcalase를 첨가한 단백가수분해물의 수율이 42.
- 단백질이 가수분해되면 가수분해도에 비례하여 available amino group이 증가하므로 이는 펩타이드의 함량을 나타내는 지표가 될 수 있다. 각 효소를 이용하여 시간에 따른 단백가수분해도를 알아보기 위해 효소별 단백가수분해물의 펩타이드 함량을 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간별로 측정하였다(Fig. 2). 효소별 단백가수분해물을 이용하여 시간에 따른 분해능을 tyrosine의 함량으로 환산한 결과, 24시간 반응 후 available amino group 농도는 alcalase, flavourzyme, neutrase가 각각 4,781.
- 각 효소별 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해 특성을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 이용하여 가수분해물의 단백질 패턴을 측정하였다. SDS-PAGE는 15% gel을 사용하였으며, 각 가수분해물은 3,000×g, 4°C, 10분 원심분리 후 얻은 상등액 20 μL를 gel에 loading 하여 80 V에서 약 2시간 전기영동한 다음, coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하고 10% acetic acid가 함유된 30% 메탄올을 이용하여 탈색시켰다.
- 기질 대비 단백질 가수분해 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain)를 각각 1%(w/w)가 되도록 첨가하여 55°C, 100 rpm에서 0~24시간 동안 가수분해 하였고, 90°C에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화하였다.
- 단백질 가수분해물의 경우 저분자량 펩타이드가 쉽게 체내로 흡수되고 체내 이용률도 높다는 보고(22)에 따라 가수분해가 활발히 일어났던 alcalase, flavourzyme, neutrase 가수분해물을 분자량 3 kDa 이하로 한외여과 한 후 동결 건조하여 실험에 이용하였다. 각 단백가수분해물의 저분자 펩타이드 생산 효율을 비교하기 위해 전체 기질의 고형분 함량에 대하여 3 kDa 이하로 분리한 후의 펩타이드의 무게를 측정하였으며 그 수율을 비교하였다(Table 1).
- SDS-PAGE는 15% gel을 사용하였으며, 각 가수분해물은 3,000×g, 4°C, 10분 원심분리 후 얻은 상등액 20 μL를 gel에 loading 하여 80 V에서 약 2시간 전기영동한 다음, coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하고 10% acetic acid가 함유된 30% 메탄올을 이용하여 탈색시켰다. 단백질 패턴의 분석은 Gel Logic 2200 PRO Imaging System(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA)을 이용하여 polyacrylamide gel을 스캐닝한 후 이미지로 영상화시켰다. 이때 molecular weight marker는 Bio-Rad Laboratories(Carlsbad, CA, USA)의 제품을 이용하였다.
- 산소의 환원 대사물질인 hydrogen peroxide는 다양한 외부요소나 정상세포의 mitochondria와 peroxisome에서 형성되는데 DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 불포화지방산과 같은 생체막의 구성성분을 공격하여 과산화지질을 생성함으로써 생체 기능의 저하나 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다(26,27). 본 연구에서는 peroxidase의 기질인 ABTS를 이용하여 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 H2O2 소거 활성을 측정하였다. 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 H2O2 소거 활성을 RC50값으로 나타낸 결과를 Table 4에 나타내었다.
- 상기 3가지 항산화 실험과 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드의 생산 수율 결과를 종합해 보았을 때 3종의 갈색거저리 유충 단백가수분해물 중 항산화 활성이 상대적으로 높았으며, 3 kDa 이하 저분자 펩타이드의 생산이 42.05%로 가장 높았던 alcalase 단백가수분해물을 이용하여 100~800 μg/mL의 농도로 지질과산화물의 산화 억제 활성을 시간별로 측정하여 Fig. 3에 표시하였다.
대상 데이터
- 가수분해도 측정을 위해 사용된 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid picrylsulfonic acid(TNBS)는 G-Biosciences Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 특별한 언급이 없는 그 밖의 분석용 시약 및 유기용매는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 주 시료는 2016년 3월 18일에 농업법인회사 (주)MG내츄럴(전남 담양군 무정면)에서 생산, 판매된 것으로 동결 건조된 갈색거저리 유충을 구입하여 -20°C 동결고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다. Alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 단백질 분해 효소는 Novo사 제품을 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 가수분해도 측정을 위해 사용된 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid picrylsulfonic acid(TNBS)는 G-Biosciences Co.
- 단백가수분해물은 동결 건조한 후 -20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 주 시료는 2016년 3월 18일에 농업법인회사 (주)MG내츄럴(전남 담양군 무정면)에서 생산, 판매된 것으로 동결 건조된 갈색거저리 유충을 구입하여 -20°C 동결고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 2)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a,b) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 3)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a,b) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 3)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) at the same day are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 또한, 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan’s multiple range test 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다.
- 모든 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준오차(mean±SE)로 나타내었으며, 통계분석에는 SPSS Statistics 23(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용되었다.
이론/모형
- Hydrogen peroxide 소거 활성 측정은 Müller(25)의 방법에 따라 증류수에 농도별로 희석한 시료 20 μL, PBS 100 μL, 1 mM H2O2 20 μL를 96-well plate에 가한 후 37°C incubator에서 5분간 반응시켰다.
- TNBS 방법(G-Biosciences Co.)을 이용하여 효소제 처리 시간에 따른 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 가수분해도를 측정하였다(22). 10 mM sodium bicarbonate(pH 8.
성능/효과
- 09 μg/mL로 나타났다. Alcalase 및 neutrase 처리 누에번데기 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 갈색거저리 유충 단백가수분해물과 유사한 경향을 보였으나, trypsin, pepsin의 경우 소거 활성이 다소 낮은 경향을 보였다.
- 각 단백가수분해물의 저분자 펩타이드 생산 효율을 비교하기 위해 전체 기질의 고형분 함량에 대하여 3 kDa 이하로 분리한 후의 펩타이드의 무게를 측정하였으며 그 수율을 비교하였다(Table 1). Alcalase를 첨가한 단백가수분해물의 수율이 42.05%로 가장 높았으며, neutrase 30.01%, flavourzyme 26.27% 순으로 나타났다. 이상의 결과는 alcalase를 처리한 단백가수분해물이 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드를 가장 많이 함유하고 있다는 것을 의미하며, neutrase와 flavourzyme을 처리한 가수분해물이 alcalase 가수분해물보다 저분자 펩타이드 생산 효율이 상대적으로 떨어지는 것을 알 수 있다.
- DPPH 라디칼 소거 활성에 대한 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 영향을 50% 라디칼 저해율을 나타내는 RC50값으로 나타낸 결과 alcalase 단백가수분해물의 RC50값은 339.34 μg/mL, flavourzyme 379.35 μg/mL, neutrase 398.93 μg/mL로 나타나 alcalase 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높았다(Table 2).
- Neutrase 처리를 통해 얻은 단백가수분해물의 RC50값은 29.84 μg/mL였고, alcalase, flavourzyme 단백가수분해물의 ABTS 라디칼에 대한 RC50값은 각각 36.90 μg/mL, 56.03 μg/mL로 나타나 neutrase 단백가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
- 효소별 단백가수분해물을 비효소군과 비교한 결과, 비효소군보다 alcalase 단백가수분해물이 10 kDa 이하로 모두 분해되어 10 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않았으며, 저분자 펩타이드가 많고 가수분해도가 우수함을 확인하였다. Neutrase와 flavourzyme 단백가수분해물은 alcalase 단백가수분해물보다 10 kDa 이상의 큰 분자량의 단백가수분해물이 다수 관찰되었다. 반면, bromelain, papain 단백가수분해물에서는 10~25 kDa 사이의 단백질 띠가 선명하여 이 분자량 크기의 펩타이드를 많이 함유한 것을 확인하였다.
- Neutrase와 flavourzyme 단백가수분해물은 alcalase 단백가수분해물보다 10 kDa 이상의 큰 분자량의 단백가수분해물이 다수 관찰되었다. 반면, bromelain, papain 단백가수분해물에서는 10~25 kDa 사이의 단백질 띠가 선명하여 이 분자량 크기의 펩타이드를 많이 함유한 것을 확인하였다.
- 시간이 지날수록 음성대조구의 지질과산화물이 증가하였으며, 음성 대조구의 3일째 흡광도 값을 100%로 봤을 때 alcalase 단백가수분해물은 100, 200, 400, 800 μg/mL의 농도에서 농도가 높아짐에 따라 지질과산화물이 각각 27, 33, 40, 68%로 유의적으로 산화가 억제됨을 확인하였다.
- 하지만 bromelain, papain 단백가수분해물은 SDS-PAGE 결과와 유사하게 24시간 처리에도 불구하고 유의한 available amino group 함량의 증가를 보이지 않았다. 이를 종합해 볼 때 alcalase, flavourzyme 및 neutrase에 대한 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해는 6~8시간이 경과하면서 가수분해가 충분히 이루어지며, 펩타이드 chain의 N-terminal을 분해하는 exo-peptidase인 flavourzyme을 처리했을 때 가장 많은 available amino group이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
- 27% 순으로 나타났다. 이상의 결과는 alcalase를 처리한 단백가수분해물이 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드를 가장 많이 함유하고 있다는 것을 의미하며, neutrase와 flavourzyme을 처리한 가수분해물이 alcalase 가수분해물보다 저분자 펩타이드 생산 효율이 상대적으로 떨어지는 것을 알 수 있다.
- 이상의 결과들을 토대로 alcalase, flavourzyme 및 neutrase 효소를 처리한 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능에서는 alcalase 단백가수분해물이 가장 높았으며 ABTS 라디칼 소거능은 neutrase 단백가수분해물이 가장 높게 나타나 상대적으로 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 알 수 있다. 본 연구에서는 저분자 펩타이드 생산을 목적으로 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드의 수율이 42.
- 이상의 결과에서 alcalase 가수분해물은 DPPH 라디칼 소거능에서 RC50값이 339.34 μg/mL로 가장 효과가 좋았으며(P<0.05), neutrase 가수분해물은 ABTS 라디칼 저해 활성에서 RC50값이 29.84 μg/mL로 가장 효과가 좋았다(P<0.05).
- 폴리페놀 성분이 함유되어 있는 식물성 시료에서 ABTS 라디칼 및 H2O2 소거능을 측정한 Lee 등(31)의 연구 결과에 따르면 80% 메탄올 아보카도의 과육 추출물은 200 μg/mL에서 38.4%로 나타났고, 본 연구에서 사용한 갈색거저리 유충 alcalase 단백가수분해물은 50 μg/mL에서 69.80%, flavourzyme은 49.38% 및 neutrase는 71.41%로 ABTS 라디칼 소거 활성능이 우수한 것으로 나타났다(data not shown).
- 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물에 따른 H2O2 소거능을 측정한 결과, alcalase 단백가수분해물의 RC50값은 65.97 μg/mL였으며, flavourzyme 121.67 μg/mL 및 neutrase 70.38 μg/mL로 나타났다.
- 1에 나타내었다. 효소별 단백가수분해물을 비효소군과 비교한 결과, 비효소군보다 alcalase 단백가수분해물이 10 kDa 이하로 모두 분해되어 10 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않았으며, 저분자 펩타이드가 많고 가수분해도가 우수함을 확인하였다. Neutrase와 flavourzyme 단백가수분해물은 alcalase 단백가수분해물보다 10 kDa 이상의 큰 분자량의 단백가수분해물이 다수 관찰되었다.
- 효소별 단백가수분해물을 이용하여 시간에 따른 분해능을 tyrosine의 함량으로 환산한 결과, 24시간 반응 후 available amino group 농도는 alcalase, flavourzyme, neutrase가 각각 4,781.38 μg/mL, 5,429.35 μg/mL, 3,155.55 μg/mL로 측정되었다.
후속연구
- 이상의 결과들을 토대로 alcalase, flavourzyme 및 neutrase 효소를 처리한 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능에서는 alcalase 단백가수분해물이 가장 높았으며 ABTS 라디칼 소거능은 neutrase 단백가수분해물이 가장 높게 나타나 상대적으로 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 알 수 있다. 본 연구에서는 저분자 펩타이드 생산을 목적으로 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드의 수율이 42.05%로 가장 높았던 alcalase 가수분해물을 이용하였으나 항산화 활성 평가 결과에 따라 flavourzyme 및 neutrase 단백가수분해물도 새로운 기능성 식품 및 소재 개발 등에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 특히 성공적인 기능성 소재 개발을 위해서는 갈색거저리 유충 단백가수분해물로부터 항산화 펩타이드의 구조 규명과 더불어 구성 아미노산의 종류 및 길이와 항산화 활성과의 상관성에 대한 규명이 추가되어야 할 것이다.
- 05%로 가장 높았던 alcalase 가수분해물을 이용하였으나 항산화 활성 평가 결과에 따라 flavourzyme 및 neutrase 단백가수분해물도 새로운 기능성 식품 및 소재 개발 등에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 특히 성공적인 기능성 소재 개발을 위해서는 갈색거저리 유충 단백가수분해물로부터 항산화 펩타이드의 구조 규명과 더불어 구성 아미노산의 종류 및 길이와 항산화 활성과의 상관성에 대한 규명이 추가되어야 할 것이다.
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