[논문]알칼리 법으로 추출한 갈색거저리 유충 단백질의 항염증 효능

서민철; 이화정; 이준하; 백민희; 김인우; 김선영; 황재삼; 김미애

doi:10.5352/jls.2019.29.8.854

알칼리 법으로 추출한 갈색거저리 유충 단백질의 항염증 효능
A Study of the Anti-inflammatory Effect of Protein Derived from Tenebrio molitor Larvae 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.8, 2019년, pp.854 - 860

초록
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본 연구에서는 탈지된 갈색거저리 유충으로부터 효율적인 단백질 추출법 확립을 위한 최적 pH 조건을 조사하였다. 단백질 추출 pH 조건은 7부터 12까지 사용하였으며, 단백질 침전 pH는 2, 4, 그리고 6을 사용하였다. 이러한 조건에서 추출한 단백질의 함량, 갈변도 및 회수량을 분석한 결과 갈색거저리 유충 단백질의 최적 추출 조건은 단백질의 갈변도를 최소화 할 수 있으며 32.4%의 회수율을 나타내는 용출 pH 9.0와 침전 pH 4.0로 결정하였다. 다음으로 알칼리 추출법으로 추출한 갈색거저리 유충 단백질의 항염증 효능을 검토하였다. 갈색거저리 유충 단백질이 LPS에 의해 활성화 되는 대식세포의 염증반응 개선효과를 확인하기 위하여 염증매개 인자인 nitric oxide(NO)의 생성 및 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 측정하였다. 그 결과 갈색거저리 유충 단백질은 세포독성 없이 NO의 생성을 억제 하였으며, MAPK 와 $NF-{\kappa}B$ 신호전달 억제를 통하여 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 감소시켰다. 이러한 연구결과는 갈색거저리 유충 단백질이 항염증 치료제 및 단백질 보충제 개발을 위한 잠재적 가능성을 가지고 있는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the optimum pH conditions for efficient extraction of protein from defatted Tenebrio molitor (TM) larvae. We examined the anti-inflammatory effect of protein derived from defatted TM larvae obtained by an alkaline extraction method. Six extraction pH values (7, 8, 9, 10, 11, and 12) and three precipitation pH values (2, 4, and 6) were used. The protein content, browning degree, and recovery yield of the protein obtained under each pH condition were determined. For efficient extraction of protein from defatted TM larvae, a combination of an extraction pH of 9 and precipitation pH of 4 resulted in a 32.4% recovery yield based on the extraction value and degree of browning. To determine whether the protein ameliorated inflammation by inhibition of macrophage activation by lipopolysaccharides (LPS), we measured nitric oxide (NO), cyclooxygenase-2 (COX-2), and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in LPS-stimulated raw 264.7 macrophage cells. The protein markedly inhibited the production of NO without cytotoxicity and reduced the expression level of COX-2 and iNOS protein through the regulation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$) signaling. These results suggested that protein derived from TM larvae could have potential applications in anti-inflammatory therapeutic agents and protein supplements.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Optimal condition of protein extraction on defatted Tenebrio molitor larvae by alkaline method. (A) Protein content and browning degree of the extracts obtained at different extraction pH values. (B) Comparison of the protein contents of the pellet and the supernatant obtained at different extraction pH and precipitation pH values.
그림 Fig. 2. Tenbrio molitor larvae protein (TMP) on the cell viability and NO production in Raw 264.7 macrophage cells. (A) Raw 264.7 macrophage cells (8×10⁴ cells/well in a 96-well plate) were pretreated with TMP for 1 hr prior to incubation with LPS (100 ng/ml) for 24 hr. The nitrite in the culture media was measured with the Griess reagent. (B) Raw 264.7 macrophage cells (6×10⁴ cells/well in a 96-well plate) were incubated with TMP (mg/ml) for 24 hr, and cell viability was assessed using MTS assay.
그림 Fig. 3. Inhibitory effect of TMP on iNOS and COX-2 expression in LPS stimulated Raw 264.7 macrophage cells. Raw 264.7 cells (1.2×10⁶ cells/well in a 6-well plate) were incubated for 24 hr, and the cells were treated with TMP (mg/ml) for 1 hr prior to incubation with LPS (100 ng/ml) for 24 hr. The expression level of iNOS and COX-2 were determined by Western blot. The data were normalized to β-actin.
그림 Fig. 4. Inhibitory effect of TMP on MAPKs signaling pathways. Raw 264.7 macrophage cells (1.2×10⁶ cells/well in a 6-well plate) were incubated with the indicated concentration of TMP (mg/ml). Protein was then isolated at 30 min after LPS treatment, and phosphorylation of ERK, p38, and JNK was detected using Western blot. The data were normalized to total protein, respectively.
그림 Fig. 5. Inhibitory effect of TMP on AKT/NF-κB signaling pathways. Raw 264.7 macrophage cells (1.2×10⁶ cells/well in a 6-well plate) were incubated with the indicated concentration of TMP (mg/ml). Protein was then isolated at 30 min after LPS treatment, and phosphorylation of AKT and degradation of IκB was detected using Western blot. The data were normalized to total protein or β-actin, respectively.

AI 본문요약
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문제 정의

특히 갈색거저리 유충의 경우 대두보다 필수아미노산을 많이 함유하고 있어 양질의 단백질 급원 식품임이 밝혀져 있으나, 산업적으로 곤충 단백질의 추출법 및 생리활성에 대한 기능성 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 알칼리 추출법을 이용하여 영양적으로 우수한 갈색거저리 유충 단백질을 보다 효율적으로 분리할 수 있는 조건을 조사하였으며, 분리된 단백질의 항염증 효능에 대한 기능성 분석을 수행하였다.

제안 방법

그 후 갈색거저리 단백질을 100, 500, 1,000 그리고 2,000 ug/ ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 후 MTS3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) reagent를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
5, 그리고 2 mg/ml의 농도로 1시간 처리한 후에 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다. 24시간 추가 배양 후 배양액 100 ul을 취하여 Griess 시약과 반응 시킨 후 multi detector (Beckman, DTX 8800, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Nitrite 표준곡선을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다.
Raw 264.7 세포로부터 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 생성되는 nitric oxide (NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂^- 의 형태로써 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.
Raw 264.7세포에 대한 갈색거저리 단백질의 세포독성 및 세포증식을 확인하기 위하여 Raw 264.7 세포를 96 well-plate에 6.0×104cells/well로 분주하여 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 10% FBS가 들어있는 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다.
용출 pH에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 갈변도는 Song 등[27]의 방법에 따라 단백질 수용액의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 420 nm에서 측정하였다. 각 시료에 단백질 응집을 인한 파장의 산란을 최소화하기 위해 16%(w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하였으며, 대조구는 증류수에 16% SDS를 첨가하여 사용하였다.
갈색거저리 유충 단백질이 LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 대식세포로부터 생성되는 NO의 합성효소인 iNOS 단백질과 PGE2의 합성효소인 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 western blot을 통하여 확인하였다(Fig. 3). Raw 264.
갈색거저리 유충의 단백질 추출은 알칼리 추출법을 사용하였으며[7, 26] 추출 시 pH 변화에 의한 단백질 특성 및 단백질 추출 함량의 변화를 확인하기 위해 각 시료를 pH 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 나누어 용출하고 단백질을 정량 하였다. 그 결과 용출 pH가 증가할수록 단백질의 용출량이 증가 하였으나 용출 pH가 증가 할 수록 갈변도 또한 증가하는 경향을 나타내었다.
0)를 가하여 여러 차례 수세한 후, 다시 원심분리 하여 침전물을 얻었고 다시 증류수를 가하여 충분히 균질화 하였다. 균질화한 단백질 수용액의 pH를 7.0으로 중화 시키고 단백질 함량을 측정하였으며, 동결건조 후 Protease inhibitor (Protease Inhibitor Cocktail, ThermoFisher)가 1% (v/v) 첨가된 물에 녹여서 실험에 사용하였다.
2×10⁶ cells/well의 농도로 6 well-plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 갈색거저리 단백질을 1시간 동안 농도별로 전처리 한 후 LPS를 이용하여 염증 반응을 유도하였다. 염증반응이 유도된 Raw 264.
그러므로 본 연구에서는 갈색거저리 유충 단백질이 LPS에 의해 유도되는 AKT 인산화와 IκB degradation에 미치는 영향을 western blot을 통하여 확인하였다(Fig.5).
MAP kinases (JNK, ERK, p38)는 세포질에서 인산화 되지 않은 상태로 존재하다가 LPS 등에 의해 자극이 가해지면 인산 화되어 염증반응을 조절하는 중요한 인자이며 iNOS와 COX-2 발현이 조절되는 과정에서도 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되어 있다[19]. 따라서 갈색거저리 유충 단백질이 LPS에 의해 유도되는 염증반응 에서 MAPKs의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위해, LPS에 의해 증가하는 MAPKs의 인산화 변화를 Western blot을 통하여 확인하였다(Fig. 4). 그 결과 LPS의 처리에 의해서 증가한 MAPKs의 인산화가 갈색거저리 유충 단백질의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
분리된 단백질은 PVDF membrane으로 transfer 한 후 비특이적 단백질에 대한 반응을 차단시키기 위해 membrane을 5% skim milk 용액으로 1시간 blocking 한 후 COX-2, iNOS, phospho-ERK1/2, phospho-p38 MAPK, phospho-JNK, phospho-Akt antibody (1:1,000; Cell Signaling Technology, Denver, MA, USA), β-Actin, IκB antibody (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체를 4℃에서 overnight으로 배양하였고, 그 후 각 항체에 대한 2차 항체 (1:10,000; Promega, Maddison, WI, USA)를 반응 시킨 후 ECL kit를 이용하여 단백질 발현 변화를 확인 하였다.
7 세포를 PBS로 세척한 뒤 protease와 phosphatase inhibitor가 함유된 RIPA buffer 를 사용하여 세포를 lysis하였고 12,000 rpm에서 원심 분리 후 상등액을 얻었다. 분리한 단백질은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 정량 하였으며, 동일 양의 단백질을 SDS-PAGE gel 전기영동을 수행하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane으로 transfer 한 후 비특이적 단백질에 대한 반응을 차단시키기 위해 membrane을 5% skim milk 용액으로 1시간 blocking 한 후 COX-2, iNOS, phospho-ERK1/2, phospho-p38 MAPK, phospho-JNK, phospho-Akt antibody (1:1,000; Cell Signaling Technology, Denver, MA, USA), β-Actin, IκB antibody (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체를 4℃에서 overnight으로 배양하였고, 그 후 각 항체에 대한 2차 항체 (1:10,000; Promega, Maddison, WI, USA)를 반응 시킨 후 ECL kit를 이용하여 단백질 발현 변화를 확인 하였다.
그 결과 다양한 알칼리 조건에서 용출한 단백질을 pH 4로 침전시켰을 때 가장 많은 단백질이 침전되었음을 확인 할 수 있었으나 회수한 단백질의 10-30%는 여전히 상등 액에 남아 있었다. 비록 pH 10에서 용출한 단백질을 pH 4에서 침전시킬 경우 가장 높은 회수율을 나타내었지만 pH 10에서의 갈변도를 고려하여 알칼리를 이용한 갈색거저리 유충 단백질의 최적 추출조건은 용출 pH 9와 침전 pH 4로 결정하였다.
7 세포는 DMEM 배지를 이용하여 8×10⁴ cells/well로 조절한 후 96 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 갈색거저리 단백질을 0.1, 0.5, 그리고 2 mg/ml의 농도로 1시간 처리한 후에 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다. 24시간 추가 배양 후 배양액 100 ul을 취하여 Griess 시약과 반응 시킨 후 multi detector (Beckman, DTX 8800, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Nitrite 표준곡선을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다.
탈지된 갈색거저리는 압착 탈지방법을 통해 얻었으며 탈지된 갈색거저리를 분쇄기로 분쇄한 후 사용하였다. 알칼리 추출 갈색거저리 단백질은 Gnanasmbandam 및 Shen 등[7, 26] 의 방법을 변형하여 추출하였다. 단백질을 용출하기 위하여 탈지 갈색거저리 분말 20 g에 100 ml의 증류수를 넣고 NaOH 를 이용하여 pH 9.
이러한 물질들의 생성 조절이 적절히 이루어지는 상태에서는 선천성 및 후천성 면역을 조절하는데 중요한 역할을 하지만, 과잉 생산 되었을 때에는 만성염증 및 자가면역질환 등을 유발하기도 한다 [8, 10]. 알칼리 추출법을 이용하여 분리한 갈색거저리 유충 단백 질이 LPS로 활성화된 Raw 264.7 대식세포에서 nitric oxide (NO) 생산과 세포성장에 미치는 영향을 관찰 하였다. 그 결과 LPS로 활성화된 Raw 264.
시료 20 ul에 BCA reagent (bicinchoninic acid solution : copper(II) sulfate pentahydrate 4% solution=50 : 1, v/v) 160 ul를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 단백질 함량은 bovine serum albumin (BSA)를 표준시료로 작성한 검량곡선을 이용하여 산출하였다.
2A). 이러한 NO의 감소가 갈색거저리 단백질에 의한 세포생존율 변화 때문인지 확인하기 위하여 Raw 264.7 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 갈색거저리 단백질을 농도별로 24시간 처리하여 세포 생존율을 확인 하였다(Fig. 2B). 그 결과, 갈색거저리 유충 단백질은 2 mg/ml의 농도에서도 독성을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다.
추출단백질의 회수를 위하여 용출단백질의 갈변화가 적은 pH 조건(pH 8-10)에서 용출시킨 각각의 시료를 분획 당 세 가지로 나누어 pH 2, 4 및 6에서 등전점 침전으로 단백질을 회수 하였다(Fig. 1B). 그 결과 다양한 알칼리 조건에서 용출한 단백질을 pH 4로 침전시켰을 때 가장 많은 단백질이 침전되었음을 확인 할 수 있었으나 회수한 단백질의 10-30%는 여전히 상등 액에 남아 있었다.

대상 데이터

한국 세포주 은행으로부터 분양 받은 마우스 대식세포 세포주 Raw 264.7은 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배지에 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 5% CO2 조건하에서 37℃ 로 유지되는 배양기에서 배양하여 사용하였다.

데이터처리

Level of significance was identified statistically using Student’s test.
모든 실험 결과는 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균과 표준편차(mean ± SD)로 나타냈다.
실험 군 간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 이용하였으며, p<0.05일 때 군 간의 차이가 유의적인 것으로 판단하였다.

이론/모형

단백질 함량은 bicinchoninic acid (BCA) 법으로 측정하였다. 시료 20 ul에 BCA reagent (bicinchoninic acid solution : copper(II) sulfate pentahydrate 4% solution=50 : 1, v/v) 160 ul를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
용출 pH에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 갈변도는 Song 등[27]의 방법에 따라 단백질 수용액의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 420 nm에서 측정하였다. 각 시료에 단백질 응집을 인한 파장의 산란을 최소화하기 위해 16%(w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하였으며, 대조구는 증류수에 16% SDS를 첨가하여 사용하였다.

성능/효과

AKT 인산화는 LPS 단독 처리 군에서 증가 하였으나 갈색거 저리 유충 단백질을 함께 처리한 경우 단백질 농도에 의존적으로 인산화가 감소하였으며, 이와 동반하여 LPS에 의해 유도된 IκB 단백질의 degradation이 갈색거저리 유충 단백질의 농도에 의존적으로 억제됨을 확인 할 수 있었다.
3). Raw 264.7 세포에 LPS를 단독으로 처리하여 염증반응을 유도 시켰을 때 대조군에 비해 각각 약 4-5배 이상 증가하였으며, 갈색거저리 유충 단백질을 농도별(0.1~2 mg/ml)로 함께 처리한 경우 단백질의 처리농도에 의존적으로 iNOS와 COX-2 단백질의 발현이 현저히 억제됨을 확인 할 수 있었다.
7 대식세포에서 nitric oxide (NO) 생산과 세포성장에 미치는 영향을 관찰 하였다. 그 결과 LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에 0.1, 0.5, 1 그리고 2 mg/ml 의 갈색거저리 단백질을 각각 처리한 결과, 농도 의존적으로 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2A). 이러한 NO의 감소가 갈색거저리 단백질에 의한 세포생존율 변화 때문인지 확인하기 위하여 Raw 264.
4). 그 결과 LPS의 처리에 의해서 증가한 MAPKs의 인산화가 갈색거저리 유충 단백질의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 갈색거저리 유충 단백질이 대식 세포에서 LPS에 의해 활성화되는 MAPKs의 활성 경로 억제를 통해 항염증 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
1B). 그 결과 다양한 알칼리 조건에서 용출한 단백질을 pH 4로 침전시켰을 때 가장 많은 단백질이 침전되었음을 확인 할 수 있었으나 회수한 단백질의 10-30%는 여전히 상등 액에 남아 있었다. 비록 pH 10에서 용출한 단백질을 pH 4에서 침전시킬 경우 가장 높은 회수율을 나타내었지만 pH 10에서의 갈변도를 고려하여 알칼리를 이용한 갈색거저리 유충 단백질의 최적 추출조건은 용출 pH 9와 침전 pH 4로 결정하였다.
갈색거저리 유충의 단백질 추출은 알칼리 추출법을 사용하였으며[7, 26] 추출 시 pH 변화에 의한 단백질 특성 및 단백질 추출 함량의 변화를 확인하기 위해 각 시료를 pH 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 나누어 용출하고 단백질을 정량 하였다. 그 결과 용출 pH가 증가할수록 단백질의 용출량이 증가 하였으나 용출 pH가 증가 할 수록 갈변도 또한 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 pH 10 이후부터는 용출된 단백질의 갈변도가 급격히 증가하기 시작하였다(Fig.
2B). 그 결과, 갈색거저리 유충 단백질은 2 mg/ml의 농도에서도 독성을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다. 따라서 갈색거저리 단백질의 항염증 효능 실험들에서 사용한 최고농도는 세포독성을 나타내지 않는 2,000 μg/ml 이하의 농도로 결정하였다.
또한 높은 알칼리 용출 조건은 lysinoalanine과 같은 잠재독소물질을 생성 시킬 수 있으며, 섬유질과 같은 다른 성분들도 함께 용출되어 단백질의 품질을 떨어트리는 것으로 보고되고 있다[27]. 따라서 갈색거저리 유충 단백질의 알칼리 용출 pH는 갈변화가 본격적으로 증가하기 이전 구간인 pH 9가 적절한 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm)란?	또한 단백질 이외에 10~40%를 차지하는 불포화지방산, 탄수화물, 무기질, 비타민 등 다양한 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 영양학적 가치기 매우 큰 것으로 보고되고 있다[2, 9]. 그 중에서 갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로 한국을 비롯한 전세계에 분포하며 최근에는 서양에서도 식용으로 많이 이용되고 있으며 캐나다 등지에서는 갈색거저리를 이용한 소스 개발, 견과류 제조 등에 관한 레시피를 보고한 바 있다[6]. 또한 본 연구팀에서는 갈색거저리 식품원료화를 위한한 분말 제조조건 확립 및 영양성분 및 유해물질 분석에 따른 영양적 가치를 보고하였으며[4, 29], 최근 갈색거저리 유충 추출물을 이용한 기능성 연구를 통하여 갈색거저리 유충이 식욕조절 및 지방세포분화 억제를 통한 항비만 효능뿐만 아니라 항염증 효능과 같은 다양한 기능성을 가지고 있는 것으로 확인 되었다[13, 23, 25, 31].
	갈색거저리의 영양성분 함량 분포는?	갈색거저리의 영양성분은 동결건조물을 기준으로 수분 2.9 %, 조단백질 50.3%, 조지방 33.7%, 조회분 3.7%, 조섬유 4.8%, 탄수화물 9.3%로서 단백질 함량이 매우 높은 고단백질 소재로서 2016년 식용곤충 원료로 식품공전에 등록됨으로써 이의 활용에 대한 관심이 매우 높아지고 있다[2, 4]. 특히 갈색거저리 유충의 경우 대두보다 필수아미노산을 많이 함유하고 있어 양질의 단백질 급원 식품임이 밝혀져 있으나, 산업적으로 곤충 단백질의 추출법 및 생리활성에 대한 기능성 연구는 아직 미비한 실정이다.
	갈색거저리 유충의 단백질 추출 시, pH 증가에 따른 변화는?	갈색거저리 유충의 단백질 추출은 알칼리 추출법을 사용하였으며[7, 26] 추출시 pH 변화에 의한 단백질 특성 및 단백질 추출 함량의 변화를 확인하기 위해 각 시료를 pH 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 나누어 용출하고 단백질을 정량 하였다. 그 결과 용출 pH가 증가할수록 단백질의 용출량이 증가 하였으나 용출 pH가 증가할 수록 갈변도 또한 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 pH 10 이후부터는 용출된 단백질의 갈변도가 급격히 증가하기 시작하였다(Fig. 1A).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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