LPS로 자극된 대식세포에서의 NF-κB와 MAPK 활성 조절을 통한 참까막살(Polyopes affinis) 에탄올 추출물의 항염증 효과 Anti-Inflammatory Effect of Ethanolic Extract from Polyopes affinis through Suppression of NF-κB and MAPK Activation in LPS-Stimulated RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구에서는 참까막살에탄올 추출물(PAEE)의 항염증 활성을 확인하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서의 pro-inflammatory cytokine 및 NO의 분비 생성량과 western blot으로 단백질 발현량을 측정하였다. 또한, croton oil로 유도된 귀 부종 모델을 이용하여 알아보았다. RAW 264.7 세포에서 PAEE를 $0.1{\sim}100{\mu}g/mL$ 농도로 처리 시 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그 결과 PAEE는 pro-inflammatory cytokine(IL-6, $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$) 및 NO의 분비량을 농도 의존적으로 억제시켰으며, iNOS와 COX-2의 발현량도 감소시킴을 확인하였다. 이러한 항염증 활성결과는 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs전사인자의 활성 억제에 의한 것으로 확인되었다. 또한, croton oil로 유도된 귀 부종 모델에서 PAEE를 50 mg/kg body weight 처리 시 귀 부종이 prednisolone(10 mg/kg body weight)과 유사한 정도로 억제됨을 확인하였다. 귀 조직 관찰에서도 PAEE는 croton oil에 의해 증가한 진피와 경피의 두께를 감소시켰으며, 진피로 침윤된 mast cell의 수도 감소시켰다. 이 결과를 종합해 보면 참까막살 에탄올 추출물은 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 활성화 억제를 통해 염증 매개 물질의 생성을 억제시켜 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 참까막살 에탄올 추출물(PAEE)의 항염증 활성을 확인하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서의 pro-inflammatory cytokine 및 NO의 분비 생성량과 western blot으로 단백질 발현량을 측정하였다. 또한, croton oil로 유도된 귀 부종 모델을 이용하여 알아보았다. RAW 264.7 세포에서 PAEE를 $0.1{\sim}100{\mu}g/mL$ 농도로 처리 시 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그 결과 PAEE는 pro-inflammatory cytokine(IL-6, $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$) 및 NO의 분비량을 농도 의존적으로 억제시켰으며, iNOS와 COX-2의 발현량도 감소시킴을 확인하였다. 이러한 항염증 활성결과는 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs 전사인자의 활성 억제에 의한 것으로 확인되었다. 또한, croton oil로 유도된 귀 부종 모델에서 PAEE를 50 mg/kg body weight 처리 시 귀 부종이 prednisolone(10 mg/kg body weight)과 유사한 정도로 억제됨을 확인하였다. 귀 조직 관찰에서도 PAEE는 croton oil에 의해 증가한 진피와 경피의 두께를 감소시켰으며, 진피로 침윤된 mast cell의 수도 감소시켰다. 이 결과를 종합해 보면 참까막살 에탄올 추출물은 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 활성화 억제를 통해 염증 매개 물질의 생성을 억제시켜 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
In this study, the anti-inflammatory effect of Polyopes affinis ethanol extract (PAEE) was investigated using LPS-stimulated RAW 264.7 cells and a croton oil-induced ICR mice model. Treatment with PAEE significantly reduced production of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines [interleukin ...
In this study, the anti-inflammatory effect of Polyopes affinis ethanol extract (PAEE) was investigated using LPS-stimulated RAW 264.7 cells and a croton oil-induced ICR mice model. Treatment with PAEE significantly reduced production of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines [interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$, and $IL-1{\beta}$] in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. PAEE treatment also reduced expression of inducible NO synthase, cyclooxygenase-2, nuclear $factor-{\kappa}B$, and mitogen-activated protein kinases in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. In the croton oil-induced ear edema test, application of PAEE (10~250 mg/kg body weight) reduced ear edema in a dose-dependent manner, and PAEE treatment at 50 mg/kg body weight showed similar inhibitory effects compared with prednisolone (10 mg/kg body weight). Histological analysis revealed reduced dermal thickness and lower number of infiltrated mast cells. These results suggest that PAEE might be used as a promising anti-inflammatory agent for inhibition of LPS-induced inflammation and ear edema formation.
In this study, the anti-inflammatory effect of Polyopes affinis ethanol extract (PAEE) was investigated using LPS-stimulated RAW 264.7 cells and a croton oil-induced ICR mice model. Treatment with PAEE significantly reduced production of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines [interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$, and $IL-1{\beta}$] in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. PAEE treatment also reduced expression of inducible NO synthase, cyclooxygenase-2, nuclear $factor-{\kappa}B$, and mitogen-activated protein kinases in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. In the croton oil-induced ear edema test, application of PAEE (10~250 mg/kg body weight) reduced ear edema in a dose-dependent manner, and PAEE treatment at 50 mg/kg body weight showed similar inhibitory effects compared with prednisolone (10 mg/kg body weight). Histological analysis revealed reduced dermal thickness and lower number of infiltrated mast cells. These results suggest that PAEE might be used as a promising anti-inflammatory agent for inhibition of LPS-induced inflammation and ear edema formation.
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문제 정의
하지만 참까막살의 대식세포에 대한 항염증 활성에 대한 보고는 되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 참까막살에 의한 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서의 염증 매개 물질의 생성억제와 croton oil로 귀 부종을 유발한 마우스에서의 염증반응 억제에 대해서 알아보고, 천연 항염증 소재로써 이용 가능성을 알아보았다.
일반적인 iNOS에 의한 NO의 생성은 세균이나 종양을 제거하는 역할을 하지만(19), 과도한 생성은 염증을 유발하여 조직의 손상, 유전자 변이, 신경손상 등을 일으키는 것으로 알려져 있다(20). 이에 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 PAEE 처리가 NO와 NO 생성과 관련된 효소인 iNOS의 발현을 억제하는지 알아보았다. 그 결과 LPS에 의해 증가한 NO의 생성이 PAEE를 0.
제안 방법
2). PAEE가 염증 매개물질인 PGE2 생성과 관련된 주요 효소인 COX-2 발현에 미치는 영향을 조사하였다. COX-2는 염증성 자극, 호르몬, 성장인자에 의해 단시간에 유도되어 발현되며, 염증과 관련된 prostanoid 생성에 중요한 역할을 한다(21).
iNOS와 COX-2의 발현량을 관찰하기 위해서는 세포에 LPS(1 μg/mL)와 PAEE(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)를 처리한 후 18시간 동안 배양하였으며, p-NF-κB p65, p-IκBα와 인산화된 MAPKs(p-ERK, p-JNK, p-p38)의 발현량은 세포에 LPS와 PAEE를 처리하고 30분 동안 배양하였다. p-NF-κB p65, p-IκBα, iNOS, COX-2 및 p-MAPKs의 경우 cytosol lysis buffer[50 mM HEPES(pH 7.
본 연구에서는 참까막살 에탄올 추출물(PAEE)의 항염증 활성을 확인하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서의 pro-inflammatory cytokine 및 NO의 분비 생성량과 western blot으로 단백질 발현량을 측정하였다. 또한, croton oil로 유도된 귀 부종 모델을 이용하여 알아보았다.
대상 데이터
귀 부종 실험에 사용한 마우스는 생후 8주령의 수컷, ICR종으로 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 온도 20±2℃, 습도 50±10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다.
본 연구에서 사용된 참까막살은 2014년도 부산 연화리에서 채취한 것으로 담수로 깨끗하게 수세한 후 자연 건조한 다음 동결 건조하여 분말화한 후 진공 포장상태로 -20℃에서 저장하며 사용하였다.
한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받은 murine macrophage cell line RAW 264.7 세포(KCLB 40071)는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% inactivated fetal bovine serum(HyClone, Victoria, Austria)과 1% penicillin-streptomycin(HyClone)을 포함한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-15AC, Sanyo, Tokyo, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
실험 결과의 통계처리는 SAS program(Statistical Analytical System V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석한 후, Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 항목 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(16). RAW 264.
PAEE의 항염증 효과를 in vivo 상에서 알아보기 위하여 Kim 등(14)과 Saraiva 등(15)의 방법으로 귀 부종 실험을 실시하였다. ICR 마우스에 PAEE를 10, 50 및 250 mg/kg･body weight 농도가 되도록 200 μL씩 경구 투여하고 한 시간 후, 오른쪽 귀에 2.
참까막살 에탄올 추출물(PAEE)의 세포독성은 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
세포질에서 인산화된 NF-κB p65와 인산화된 IκBα의 발현량을 측정한 결과(Fig. 4) LPS에 의해 증가하였으며, PAEE 처리에 의해 농도가 증가할수록 감소한 것으로 나타났다. 따라서 IκB의 인산화가 억제됨으로써 LPS에 의한 NF-κB p65의 핵 내로의 이동이 억제된 것으로 생각된다.
4). 그 결과 LPS 자극에 의해 증가한 인산화된 p38, ERK, JNK의 발현은 PAEE 처리에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 이상으로 PAEE는 LPS 자극에 의해 활성화된 RAW 264.
7 세포에서 PAEE 처리가 NO와 NO 생성과 관련된 효소인 iNOS의 발현을 억제하는지 알아보았다. 그 결과 LPS에 의해 증가한 NO의 생성이 PAEE를 0.1~100 μg/mL 농도로 처리 시 농도 의존적으로 유의하게 억제되었다(Fig. 2).
1~100 μg/mL 농도로 처리 시세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그 결과 PAEE는 pro-inflammatory cytokine(IL-6, TNF-α, IL-1β) 및 NO의 분비량을 농도 의존적으로 억제시켰으며, iNOS와 COX-2의 발현량도 감소시킴을 확인하였다. 이러한 항염증 활성 결과는 NF-κB와 MAPKs 전사인자의 활성 억제에 의한 것으로 확인되었다.
5). 그 결과 croton oil에 의해 귀 부종이 형성됨을 확인하였고, PAEE 처리 시 모든 농도에서 귀 두께가 유의하게 억제됨을 확인하였다. 특히 PAEE를 50 mg/kg 농도로 경구 투여하였을 때 시판 항염증제인 prednisolone 10 mg/kg 처리구와 유사한 귀 부종 억제 효과를 나타내었다.
특히 IL-6의 경우 50 μg/mL 이상에서 약 70% 이상의 억제율을 나타내었으며, TNF-α와 IL-1β의 경우 100 μg/mL 농도에서 약 50% 및 40% 정도의 억제율을 나타내었다. 따라서 PAEE는 IL-6, TNF-α 및 IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타내는 것으로 생각된다.
5B), PAEE 처리구는 prednisolone 처리구와 유사한 정도로 mast cell 수가 감소함을 확인하였다. 따라서 PAEE는 croton oil로 유도된 귀 부종 억제에 효과가 있음을 확인하여 염증반응의 하나인 부종 억제를 위한 예방 또는 치료제로써 이용 가능성이 높은 것으로 확인되었다.
2에서 COX-2의 발현은 LPS에 의해 증가하였으며, 농도 의존적으로 억제되었다. 따라서PAEE는 RAW 264.7 세포에서 iNOS의 발현이 감소하여 NO 생성을 감소시키는 것으로 생각되며, COX-2의 발현억제에도 감소 효과를 나타내어 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
2). 또한, LPS에 의해 NO를 생합성하는 효소인 iNOS의 세포 내 발현량을 측정한 결과, PAEE(0.1~100 μg/mL) 처리에 의해 LPS에 의해 증가한 iNOS의 발현이 농도가 증가함에 따라 유의하게 억제됨을 확인하였다(Fig. 2).
귀 조직 관찰에서도 PAEE는 croton oil에 의해 증가한 진피와 경피의 두께를 감소시켰으며, 진피로 침윤된 mast cell의 수도 감소시켰다. 이 결과를 종합해 보면 참까막살 에탄올 추출물은 NF-κB와 MAPKs의 활성화 억제를 통해 염증 매개 물질의 생성을 억제시켜 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
그 결과 LPS 자극에 의해 증가한 인산화된 p38, ERK, JNK의 발현은 PAEE 처리에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 이상으로 PAEE는 LPS 자극에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포에서 염증매개물질인 iNOS와 COX-2의 발현 및 NO와 pro-inflammatory cytokine의 생성이 NF-κB와 MAPKs의 활성 억제를 통하여 항염증 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
참까막살 에탄올 추출물(PAEE)의 항염증 활성은 어떻게 일어나는가?
귀 조직 관찰에서도 PAEE는 croton oil에 의해 증가한 진피와 경피의 두께를 감소시켰으며, 진피로 침윤된 mast cell의 수도 감소시켰다. 이 결과를 종합해 보면 참까막살 에탄올 추출물은 NF-κB와 MAPKs의 활성화 억제를 통해 염증 매개 물질의 생성을 억제시켜 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
염증반응이 과도하게 발생하거나 장기간 지속되는 경우 발생할 수 있는 만성질환은?
염증은 외부 병원체나 항원에 의한 감염 및 생체 내 자극 물질에 의한 인체 조직손상을 막는 방어기전으로 발신, 발열, 통증과 같은 증상을 수반한다(1). 그러나 염증반응이 과도하게 발생하거나 장기간 지속되는 경우 치매, 심혈관 질환, 암, 대사성 증후군 등의 만성질환을 발병할 수 있는 요인이 된다(2).
참까막살에 대한 생리활성으로 보고되어 있는 것은?
홍조류인 참까막살(Polyopes affinis)은 우리나라에서 주로 남해안이나 제주도에 서식하고 있으며, 식용이 가능하다고 알려져 있다. 참까막살에 대한 생리활성은 OVA로 유발된 알레르기성 천식 억제(10), 랫트 비만세포 의존성 아토피 반응 억제 활성(11), 항산화 활성(12), 광보호 효과(13)에 대해 보고되어 있다. 하지만 참까막살의 대식세포에 대한 항염증 활성에 대한 보고는 되어 있지 않다.
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