[논문]MC3T3-E1 세포에서 BMP2에 의한 조골세포의 분화에 일주기 유전자 Per1이 미치는 영향

민현영; 장원구

doi:10.5352/jls.2017.27.5.501

MC3T3-E1 세포에서 BMP2에 의한 조골세포의 분화에 일주기 유전자 Per1이 미치는 영향
Circadian Clock Gene Per1 Mediates BMP2-induced Osteoblast Differentiation in MC3T3-E1 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.27 no.5 = no.205, 2017년, pp.501 - 508

초록
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Bone morphogenetic proteins (BMPs)는 다양한 세포기능을 조절하는 중요한 사이토카인 중 하나이다. 최근 BMP와 일주기 유전자들이 연관되어 있다는 연구결과들이 보고되고 있지만 조골세포에서 일주기 유전자인 Per1의 역할은 아직 명확하지 않다. 본 연구에서는 조골세포 분화에서 Per1의 역할을 조사하였다. MC3T3-E1 세포에서 BMP2 처리에 의해 Per1 mRNA 발현과 luciferase 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 Per1 과발현 실험을 통해서 Per1 유전자가 Runx2, ALP, OC의 발현을 증가시켰으며 ascorbic acid와 ${\beta}$-glycerophosphate에 의한 ALP 염색과 석회화가 Per1 과발현에 의해 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 이상의 결과는 일주기 리듬을 조절하는 Per1 유전자가 조골세포의 분화를 촉진하는 인자로 작용함을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional cytokines that play important roles in a variety of cellular functions. Among BMP family members, BMP2 efficiently promotes osteoblast differentiation through Smad-mediated runt-related transcription factor 2 (Runx2) expression. Several recent studies suggest that BMPs are associated with clock genes, in particular Bmal1. Bmal1 protein heterodimerizes with Clock protein and then induces period 1 (Per1) expression. However, the role of Per1 on osteoblast differentiation remains unclear. In this study, we investigated whether Per1 is involved in osteoblast differentiation. MC3T3-E1 cells were treated with BMP2 for induction of osteoblastic differentiation. Osteogenic maker gene and Per1 mRNA expression were measured using real-time PCR. Interestingly, BMP2 treatment induced Per1 mRNA expression in MC3T3-E1 cells. To further investigate the function of Per1 on osteoblast differentiation, MC3T3-E1 cells were transiently transfected with pCMV-Per1. Per1 overexpression increased Runx2 mRNA and protein levels. Also, mRNA expression and promoter activity of osteocalcin were upregulated by Per1 overexpression. To investigate the effect of interaction between Per1 and osteogenic condition, MC3T3-E1 cells were cultured in osteogenic medium containing ascorbic acid and ${\beta}$-glycerophosphate. Osteogenic medium-induced ALP staining level and mineralization were synergistically increased by overexpression of Per1. Taken together, these results demonstrate that Per1 is a positive regulator of osteoblast differentiation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

일주기리듬이 골 대사를 조절한다고 알려져 있지만 자세한 분자적 기전에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다[3, 14]. 따라서 본 연구에서는 생체주기에 있어 중요한 역할을 하는 Per1 유전자가 조골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 조골모세포 MC3T3-E1 세포에서 BMP2에 의한 Per1 유전자의 발현양상을 조사하였으며 Per1 유전자 과발현에 의한 영향을 분석하였다.

제안 방법

Per1 유전자가 BMP2 신호전달의 주요한 타깃(target) 인자 Runx2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MC3T3-E1 세포에 pCMV-Per1 벡터를 도입하여 Per1 유전자를 과발현시켰다. 먼저 pCMV-Per1의 효과는 RT-PCR 분석을 통해 확인하였다(Fig 2A).

대상 데이터

본 실험에 사용한 MC3T3-E1 조골모세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS; Atlas, Fort Collins, Colorado, USA), 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin을 첨가한 α-minimum essential medium (αMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배양액으로 2-3일 간격으로 교환해주며 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.

데이터처리

실험결과는 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타내었고 twotailed unpaired Student’s t-test를 이용하여 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 정하였다.

이론/모형

Per1 과발현에 따른 OG2-Luciferase reporter (OG2-Luc)의 활성변화를 조사하기 위해 실시한 Luciferase reporter assay는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하였다. 24 well plate에 MC3T3-E1 세포를 분주하고 하루 배양한 후 transient transfection 방법과 동일하게 수행하였다.

성능/효과

또한 Runx2 단백질은 OC promoter의 OSE2(osteoblast specific element 2)에 결합하여 OC의 발현을 유도하기 때문에[17], OC의 발현을 조사하였다. Per1의 과발현에 의해서 OC의 mRNA 발현과 OG2-Luc의 활성이 증가하였으며 이 결과는 Runx2와 OC의 발현으로 이어지는 BMP2 신호전달 경로에 Per1 유전자가 관여하여 조골세포의 분화를 촉진할 수 있음을 시사한다. 또한 ascorbic acid와 β-glycerophosphate가 포함된 분화유도 배지 조건에서 증가한 ALP 염색 정도가 Per1 과발현에 의해 더욱 증가한 것을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 조골세포에서 사이토카인 BMP2가 시계 유전자 Per1의 발현에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자 하였다. 그 결과 조골모세포 MC3T3-E1 세포에서 BMP2에 의해 Per1의 mRNA 발현이 증가하였으며, Per1 유전자 과발현 실험을 통하여 Per1이 조골세포 분화의 핵심전사 인자로써 작용하는 Runx2의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 Runx2 단백질은 OC promoter의 OSE2(osteoblast specific element 2)에 결합하여 OC의 발현을 유도하기 때문에[17], OC의 발현을 조사하였다.
Per1의 과발현에 의해서 OC의 mRNA 발현과 OG2-Luc의 활성이 증가하였으며 이 결과는 Runx2와 OC의 발현으로 이어지는 BMP2 신호전달 경로에 Per1 유전자가 관여하여 조골세포의 분화를 촉진할 수 있음을 시사한다. 또한 ascorbic acid와 β-glycerophosphate가 포함된 분화유도 배지 조건에서 증가한 ALP 염색 정도가 Per1 과발현에 의해 더욱 증가한 것을 확인하였다. 본 연구 결과들은 BMP2에 의한 Per1의 발현이 조골세포 분화를 촉진할 수 있음을 시사한다.

후속연구

본 연구의 결과와 Per1이 갑상선 호르몬의 타깃으로 작용하는 점을 바탕으로 Per1은 골재형성에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 따라서 갑상선 호르몬이 조골세포의 골 형성을 증가시키는 과정에서 Per1이 어떻게 관여되어 있는 지에 대한 면밀한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
이러한 결과는 조골세포에서는 일반적인 core loop와는 다른 기전으로 일주기 유전자들이 작동할 수도 있음을 의미한다. 이와 관련하여 조골세포에서 일주기 유전자들이 어떠한 방식으로 작동하는 지에 대한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Bone morphogenetic proteins는 어떤 기능을 조절하는가?	Bone morphogenetic proteins (BMPs)는 다양한 세포기능을 조절하는 중요한 사이토카인 중 하나이다. 최근 BMP와 일주기 유전자들이 연관되어 있다는 연구결과들이 보고되고 있지만 조골세포에서 일주기 유전자인 Per1의 역할은 아직 명확하지 않다.
	증가된 distal-less homeobox 5는 무엇을 유도하는가?	조골세포(osteoblasts) 분화 과정에서 BMP2는 BMP수용체와 결합한 후, Smad1/5/8의 인산화를 유도하여 활성화시키고 Smad4와 결합된 복합체는 전사활성 인자로 작용하여 distal-less homeobox 5 (Dlx5)의 발현을 촉진한다. 증가된 Dlx5는 조골세포의 분화에 있어 핵심 전사 인자로 작용하는 Runx2의 발현을 유도한다[19, 20]. Runx2는 osteocalcin (OC), osteopontin, collagen typeⅠ과 같은 조골세포 분화 마커 유전자의 promoter에 결합하고 이러한 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진한다[17].
	골 형성 및 분해 대사는 무엇에 의해 조절되는가?	골 형성 및 분해 대사는 다양한 호르몬, 사이토카인(cytokine)과 여러 전사 인자(transcription factor)에 의해 조절된다. Bone morphogenetic proteins (BMPs)는 배아발생, 세포의 성장과 분화부터 뼈의 성장과 골절의 회복과정까지 다양한 세포의 기능에서 중요한 역할을 하는 사이토카인이다[11, 22, 26].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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