ENA-A(ENA actimineral resource A) 이온수가 MC3T3-E1 조골세포의 활성과 분화에 미치는 영향 Effects of ENA-A(ENA actimineral resource A) Ion Water on the Activity and Differentiation of MC3T3-E1 Osteoblastic cell원문보기
골조직은 골아세포, 파골세포, 골세포 등으로 구성되며, 골개조시 여러 인자가 세포증식, 분화, 활성화 및 골대사 조절에 관여한다. 이때 조골세포의 활성은 골형성에 중요하므로, 본 연구에서는 MC3T3-E1 조골세포주를 이용하여 해조류로 조제한 알칼리의 ENA-A 이온수가 조골세포의 증식과 분화활성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 ENA-A 이온수가 조골세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 검색법으로 조사 한 결과, ENA-A 이온수 2% 처리시 대조군과 비교하여 134% 증가하여 조골세포에 대해 높은 성장률을 보였다. 또한 ALP 효소 활성에 미치는 영향을 9일간 배양하여 그 변화를 측정하였다. 결과, 농도 1, 2, 4, 8% 처리시 112, 150, 188%까지 ALP 활성을 증가시켰다. ENA-A 이온수는 다시 ALP 효소 염색법과 Alizarin Red 염색으로 조골세포의 ALP활성유도, 분화와 석회화 형성능을 재확인하였으며 골기질 유전자의 발현의 변화도 확인하였다. 이에 본 연구결과를 통해 각종 무기질 성분을 함유한 ENA 이온수가 조골세포의 분화시에 hydroxyapatite 형성에 영향을 줌으로써 골다공증 예방에 효과가 있을것으로 생각하여 이를 보고하는 바이다.
골조직은 골아세포, 파골세포, 골세포 등으로 구성되며, 골개조시 여러 인자가 세포증식, 분화, 활성화 및 골대사 조절에 관여한다. 이때 조골세포의 활성은 골형성에 중요하므로, 본 연구에서는 MC3T3-E1 조골세포주를 이용하여 해조류로 조제한 알칼리의 ENA-A 이온수가 조골세포의 증식과 분화활성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 ENA-A 이온수가 조골세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 검색법으로 조사 한 결과, ENA-A 이온수 2% 처리시 대조군과 비교하여 134% 증가하여 조골세포에 대해 높은 성장률을 보였다. 또한 ALP 효소 활성에 미치는 영향을 9일간 배양하여 그 변화를 측정하였다. 결과, 농도 1, 2, 4, 8% 처리시 112, 150, 188%까지 ALP 활성을 증가시켰다. ENA-A 이온수는 다시 ALP 효소 염색법과 Alizarin Red 염색으로 조골세포의 ALP활성유도, 분화와 석회화 형성능을 재확인하였으며 골기질 유전자의 발현의 변화도 확인하였다. 이에 본 연구결과를 통해 각종 무기질 성분을 함유한 ENA 이온수가 조골세포의 분화시에 hydroxyapatite 형성에 영향을 줌으로써 골다공증 예방에 효과가 있을것으로 생각하여 이를 보고하는 바이다.
Culture of osteoblast is extremely valuable in analyzing biological features that are specific to bone. ENA-A, ENA actimineral resource A, is a seaweed origin alkaline water. To investigate the bioactivity of ENA which act on bone metabolism, we studied the effects of a ENA on the activity of osteob...
Culture of osteoblast is extremely valuable in analyzing biological features that are specific to bone. ENA-A, ENA actimineral resource A, is a seaweed origin alkaline water. To investigate the bioactivity of ENA which act on bone metabolism, we studied the effects of a ENA on the activity of osteoblast MC3T3-E1 cells. ENA (1, 2, 4%) dose-dependently increased survival (p<0.05) and alkaline phosphatase activity (p<0.05) on MC3T3-E1 cell. And examined histochemistry and nodule formation according to the time course. To determine the expression patterns of bone-related proteins during the MC3T3-E1 osteoblast-like cell differentiation by using RT-PCR. This study suggest that ENA may promote the function of osteoblastic cells and play an important role in bone formation.
Culture of osteoblast is extremely valuable in analyzing biological features that are specific to bone. ENA-A, ENA actimineral resource A, is a seaweed origin alkaline water. To investigate the bioactivity of ENA which act on bone metabolism, we studied the effects of a ENA on the activity of osteoblast MC3T3-E1 cells. ENA (1, 2, 4%) dose-dependently increased survival (p<0.05) and alkaline phosphatase activity (p<0.05) on MC3T3-E1 cell. And examined histochemistry and nodule formation according to the time course. To determine the expression patterns of bone-related proteins during the MC3T3-E1 osteoblast-like cell differentiation by using RT-PCR. This study suggest that ENA may promote the function of osteoblastic cells and play an important role in bone formation.
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문제 정의
그러므로 조골세포를 이용한 세포의 활성과 골형성 관련 효소 활성의 상관성을 살펴보는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이에 본연구에서는 조골세포를 이용한 in vitro screening system을 식품 유래 천연물질 중 조골활성 및 분화인자를 가지는 물질을 검색하는 방법으로 활용하였고 이를 통해 무기질 성분을 함유한 ENA-A와 골다공증 예방을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
Total RNA는 조골세포를 100 <])dish에 1x1" cells/mL로 9일간 배양한 뒤 TRI reagent (Molecular Research Center, hie.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 간단히 설명하면 배양된 세포에서 배지를 제거하고 phosphate buf fered saline (PBS, pH7.
1 N NaOH로 반응을 중지하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP activity는 p-NPP로부터 생성된 p-nitro- phenoi(p-NP)를 측정하여 p-NP에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 대조군과의 상대비교를 통해 도출하였다 [8, 19].
ALP 효소의 염색 정도를 측정하기 위해 24 well에 lxlO5 cells/mL로 처리하고 이온수를 적정농도로 희석 처리한 후 시간 경과에 따른 효소활성을 측정하였다. 염색은 alkaline phos- phatase(AP) kit (Sigma)를 사용하여 측정하였다.
ENA-A 이온수를 1, 2, 4, 8% 의 농도로 첨가하여 9일간 배양한 다음 세포내 ALP 효소의 염색정도를 확인하였다. 그 결과 Fig.
24시간 배양 후 시료처리를 하였다. ENA-A 이온수를 각 농도별 (1, 2, 4, 8%)로 넣어 세포를 배양한 후 3일 뒤 PBS 로 세척한 다음 0.1 % Triton X-100을 20 μl씩 첨가하여 37℃ 에서 30분간 lysis하였다. Lysis된 cell의 상등액 5 μl는 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상등액에 20 μl의 0.
cDNA는 Table 1의 primer들을 이용한 PCR 방법으로증폭되었다. PCR의 반응에는 2.5 U Taq polymerase (Takara Ex), 2 mM MgCh, 0.2 mM dNTP를 첨가하여 각각의 primer에 맞는 조건으로 실시하였다.
이온수를 0.WOO iig/mL농도로 처리하고 9일까지 배양하면서 ALP 효소 활성을 조사하였다. 그 결과 Fig.
측정하는 MTT assay로 측정하였다. 먼저 배양한 cell을 0.4 % trypan blue(Sigma)를 사용하여 계수한 후 lx105 cells/well로 조정하여 분주한 다음 각 시료를 최종농도 1, 10, 100 및 1, 000 yg/mL 되게 20 J1L씩 첨가한 후 37C 의 5 % CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 대조군은 시료 대신 배지를 20 11L 첨가하여 동일하게 배양하였다.
침전물에 75% 에탄올을 첨가하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수를 첨가하여 65℃ 수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 spectrophotometer와 1% form aldehyde agarose gel 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다. 분리된 total RNA 2 μl에 superscript U RT200 U, 0.
분리된 RNA는 spectrophotometer와 1% form aldehyde agarose gel 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다. 분리된 total RNA 2 μl에 superscript U RT200 U, 0.5 IJg Oligo dT, 0.5 mM dNTP를 첨가하여 42E에서 90분간 반응시킨 후 70℃에서 10분간 반응을 종결시켜 cDNA를 제조하였다. cDNA는 Table 1의 primer들을 이용한 PCR 방법으로증폭되었다.
조골세포 분화에 관련된 골기질 유전자 발현의 변화 정도를 RT-PCR 후 전기영동하여 확인하였다. Fig.
먼저, 배지를 제거하고 고정액 (citrate-acetone-formaldehyde)을 첨가하여 약 30초간 실온에 보관하였다가 45초간 증류수로 세 척하였다. 준비 된 diazordum solution (sodium nitrite : FRV-alakline : naphthol AS-BI alkaline solution = 1:1:1)을 첨가하여 약 15 분간 실온에서 방치한 뒤 2분간 증류수로 세척하고 hematox ylin solution으로 2분간 다시 염색한 뒤 흐르는 물로 염색액을 제거한 다음 현미경으로 관찰하였다[6, 9, 4이.
2로 조정하였디-. 준비한 AR solution으로 10분간 염색하고, 증류수로 2번 세척한 뒤 염색되지 않은 부분은 FBS로 씻어주면서 제거해주고 표면이 너무 마르지 않게 PBS 로 조금 적셔주면서 현미경으로 nodule 형성 정도를 관찰하였다 [20, 25, 33].
USA)로부터 분양받아 사용하였다. 최 등[6]의 방법을 참고하여 a-MEM (Gibco BRL, Grand island, N.Y” USA)배지에 10% FBS (Gibco)와 1% antibiotics (Gibco)를 첨가하여 37℃의 5 % CO2 배양기에서 2-3일 마다 계대배양을 하였으며, 분화유도를 위해 5 mM {3-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. Mo” USA) 와 50 mg/mL의 Vitamin C (Sigma)를 첨가하여 분화유도배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다[21, 27].
대상 데이터
Mouse calvaria osteoblast cell 인 MC3T3-E1 cell 은 ATCC (CRL-2593, USA)로부터 분양받아 사용하였다. 최 등[6]의 방법을 참고하여 a-MEM (Gibco BRL, Grand island, N.
본 실험에 사용한 ENA actimineral resource A (ENA-A) 는 알칼리 이온수로 식용의 오징어 (Sepia esaJenfcj)와 두 종류의 해조류 (Phymatolithon calcareum, Lithothamnion cor- allioides)를 혼합하여 제조한 것으로 (주)진주바이오푸드에서제공받아 사용하였다. ENA-A의 제조과정은 먼저 오징어의 뼈는 제거하고 해초와 함께 열을 가해 정련한 다음, 다시 1, 000 ~ 1, 100℃ 가량의 열을 가해 한 시간동안 더 정련한다.
데이터처리
실험 결과의 통계분석은 SAS program을 이용한 분산분석법을 실시하여 Duncan's multiple range test에 의 해 시료 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 성장 정도는 Green등[13] 의 방법에 따라 3-(3, 4-dimethylthiazolyl-2)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma) 시약의 환원 정도를 측정하는 MTT assay로 측정하였다. 먼저 배양한 cell을 0.
조골세포내 ALP 효소의 유도를 확인하고자 AZO 색소법 (Burstone법)으로 검토하였다. 즉, Naphthol AS-BI phos phate 기질은 조직내 존재하는 ALP효소에 의해 가수분해되어 orthophosphate와 naphthol이 유도체로 유리되고, 유리된 naphthol은 반응액에 함유되어 있는 diazonium 염과 즉시 결합하여 AZO dye를 형성하므로 적색의 효소 활성 부위를 나타내게 된다.
성능/효과
4는 MC3T3-E1 세포의 9일간 배양에 따른 분화인자의 mRNA 발현양을 나타낸 것으로, alkaline phosphatase, type II collagen, osteo- pontin의 발현이 대조군에 비해 높게 발현되었다. Alkaline phosphatase의 발현은 대조군에 비해 더 높게 나타났으며, 특히 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하였다. 또한 골기질 단백질인 type 2 collagen에서도 내조 군에 비해 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하는 경향이었다.
같다. ENA-A는 pH가 12.5 이고, Ca, Na, S, Fe, Mg, Zn, Cu, Co 등이 함유된 알칼리 이온수임을 알 수 있었다.
1과 같디-. MC3T3-E1 cell에 ENA-A 이온수를 2% 처리하였을 때 대조군과 비교하여 134% 이상의 증식률을 보였고, 1%와 4%에서는 각각 115, 132% 이상의 증식율을 보였다. 반면, 8% 첨가 시 98% 정도의 증식율을 나타낸 것으로 확인되었다.
WOO iig/mL농도로 처리하고 9일까지 배양하면서 ALP 효소 활성을 조사하였다. 그 결과 Fig. 2에서와 같이 ENA-A 이온수 4% 농도의 경우 대조군에 비해 188%까지 ALP 활성이 유도되었으며/ 그 외 2%와 8% 농도에서도 각각 150, 138% 이상의 분화 유도능을 나타내었다 (p<0.05). 이는 Caz Mg 등이 ALP 효소활성에 높은 영향을 미치는 보고[1]와 비교해 볼 때, ENA-A 이온수내에 칼슘이 함량이 높고 또한 ALP의 활성 에 co-factor로 작용하는 Mg, Co 등의 함유되어 있어 ENA-A 이온수가 높은 ALP 분화 유도 능에 영향을 미쳤다고 생각된다.
그 결과 Fig. 3(A)와 같이 시료를 처리하지 않은 대조군은 붉은색의 효소가 많이 형성되지 않은 반면, 이온수를 1, 2, 4% 처리한 군에서는 효소의 붉은 반점이 많이 생겼으며, 특히 농도별로 염색이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그러나 8% 처리 군에서는 다소 감소되는 경향을 보였다.
역시 ENA-A 이온수 4% 농도에서 조골세포가 분화됨에 따라 염색된 정도가 대조군에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 ENA-A 이온수는 MC3T3-E1 조골세포의 증식 유도, ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능이 있음을 확인하였다.
그러나 8% 처리 군에서는 다소 감소되는 경향을 보였다. 따라서 ENA-A 이온수는 조골세포내 ALP 효소활성을 유도함을 염색을 통해 확인하였다.
증가시킴을 알 수 있었다. 따라서 식용 오징어 (Sepia escu- lenta)와 두 종류의 해조류 (Phymatolithon calcareum, Litho- thamnion corallioides)를 혼합하여 제조한 알칼리 이온수인 ENA actimineral resource A (ENA-A)는 골 형성 개선에 우수한 소재임을 알 수 있었다.
이러한 칼슘의 섭취는 골질량을 증가시키며 골격을 유지하는데 필수적이다[10]. 따라서 조골세포에 vitamin C와 0 -glycerol phosphate를 첨가한 분화배지에 ENA-A 이온수 첨가 시 1%를 제외한 다른 처리군에서 ALP 분화 유도능을 나타내었고, 특히 4% 첨가군에서 가장 높은 ALP 활성이 유도됨을 알 수 있었다.
Alkaline phosphatase의 발현은 대조군에 비해 더 높게 나타났으며, 특히 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하였다. 또한 골기질 단백질인 type 2 collagen에서도 내조 군에 비해 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하는 경향이었다.
3(B)와 같다. 역시 ENA-A 이온수 4% 농도에서 조골세포가 분화됨에 따라 염색된 정도가 대조군에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 ENA-A 이온수는 MC3T3-E1 조골세포의 증식 유도, ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능이 있음을 확인하였다.
이와같이 ENA-A 이온수는 MC3T3-E1 조골세포의 증식유도, ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능이 있었으며, 조골세포 분화에 관련된 골기질 유전자인 Alkaline phosphatase, Type II collagen, osteopontin의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. 따라서 식용 오징어 (Sepia escu- lenta)와 두 종류의 해조류 (Phymatolithon calcareum, Litho- thamnion corallioides)를 혼합하여 제조한 알칼리 이온수인 ENA actimineral resource A (ENA-A)는 골 형성 개선에 우수한 소재임을 알 수 있었다.
반면, 8% 첨가 시 98% 정도의 증식율을 나타낸 것으로 확인되었다. 최[기는 대두 에탄올 추출물을 50-100 iig/mL의 농도로 조 골 세포주에 처리한 결과, 대조군에 비해 최고 117%의 증가를 나타내었다고 보고하였는데 ENA-A 이온수는 134% 이상의 조골세포의 증식을 보였으므로 대두에탄올추출물보다 훨씬 좋은 조골세포의 증식유도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
후속연구
세포수준의 연구는 거의 없는 실정이다. 그러므로 조골세포를 이용한 세포의 활성과 골형성 관련 효소 활성의 상관성을 살펴보는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이에 본연구에서는 조골세포를 이용한 in vitro screening system을 식품 유래 천연물질 중 조골활성 및 분화인자를 가지는 물질을 검색하는 방법으로 활용하였고 이를 통해 무기질 성분을 함유한 ENA-A와 골다공증 예방을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.
또한 구리와 아연의 식사섭취도 최대 골질량을 확보하고, 골밀도를 유지하는데 필요한 인자로 보고되었다[32]. 이와 같이 철, 구리, 아연과 같은 미량 무기질의 영양상태가 골밀도에 영향을 주 수 있음이 제시되고 있으나 폐경 전후의 여성을 대상으로 한 일부 보고[18, 24, 26, 3이에 그치고 있어, 가임기 젊은 여성을 대상으로 골밀도와 철, 구리, 아연 영양상태와의 상관관계를 알아보는 연구가 필요하다.
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