최근 들어 곤충을 식품 및 바이오 소재로 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 곤충을 이용한 조골세포 활성 및 분화에 따른 골 형성 촉진 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 뿐만 아니라 풀무치를 이용한 기능성 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 골 형성 촉진 효능을 가진 새로운 천연물 소재 개발을 위해 풀무치 추출물의 MG-63 조골세포의 분화 촉진 효과를 연구하였다. 조골세포에서 풀무치 추출물의 독성 및 증식 효과를 평가하기 위하여 MTS assay를 진행한 결과, $1,000{\mu}g/ml$ 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 48시간 배양했을 때 $500-1,000{\mu}g/ml$ 농도에서 105%와 116%의 세포 증식 효능을 확인 하였다. 풀무치 추출물이 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 3일 및 5일간 풀무치 추출물을 MG-63 조골세포에 처리한 후 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과 $100{\mu}g/ml$ 농도에서 positive control로 사용한 조골세포 분화배지(DM)군과 유사한 정도로 분화가 증가하였으며 500 및 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서는 2-3배까지 조골세포 분화가 촉진되었다. 이 결과는 ALP staining에서도 유사하게 나타났다. mRNA 발현량의 변화를 측정한 결과, Alpl과 Runx2 유전자 발현량이 증가하였고, 단백질 발현량을 측정했을 때에도 유사한 결과를 확인하였다. 이를 통해 ALP와 Runx2 유전자 및 단백질 발현에 의해서 ALP 활성이 증가하고 조골세포 분화가 촉진되었을 것으로 판단되며, 풀무치 추출물을 이용한 골 형성 촉진에 따른 골다공증 예방 및 치료 기능성 소재 개발에 대한 가능성을 확인하였다.
최근 들어 곤충을 식품 및 바이오 소재로 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 곤충을 이용한 조골세포 활성 및 분화에 따른 골 형성 촉진 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 뿐만 아니라 풀무치를 이용한 기능성 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 골 형성 촉진 효능을 가진 새로운 천연물 소재 개발을 위해 풀무치 추출물의 MG-63 조골세포의 분화 촉진 효과를 연구하였다. 조골세포에서 풀무치 추출물의 독성 및 증식 효과를 평가하기 위하여 MTS assay를 진행한 결과, $1,000{\mu}g/ml$ 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 48시간 배양했을 때 $500-1,000{\mu}g/ml$ 농도에서 105%와 116%의 세포 증식 효능을 확인 하였다. 풀무치 추출물이 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 3일 및 5일간 풀무치 추출물을 MG-63 조골세포에 처리한 후 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과 $100{\mu}g/ml$ 농도에서 positive control로 사용한 조골세포 분화배지(DM)군과 유사한 정도로 분화가 증가하였으며 500 및 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서는 2-3배까지 조골세포 분화가 촉진되었다. 이 결과는 ALP staining에서도 유사하게 나타났다. mRNA 발현량의 변화를 측정한 결과, Alpl과 Runx2 유전자 발현량이 증가하였고, 단백질 발현량을 측정했을 때에도 유사한 결과를 확인하였다. 이를 통해 ALP와 Runx2 유전자 및 단백질 발현에 의해서 ALP 활성이 증가하고 조골세포 분화가 촉진되었을 것으로 판단되며, 풀무치 추출물을 이용한 골 형성 촉진에 따른 골다공증 예방 및 치료 기능성 소재 개발에 대한 가능성을 확인하였다.
Insects have been investigated as a novel source of food and biomaterial in several recent studies. However, their osteoblastogenic cell activity has not been sufficiently researched and so, to investigate the potential of this natural material for promoting osteoblastogenesis, we studied the activi...
Insects have been investigated as a novel source of food and biomaterial in several recent studies. However, their osteoblastogenic cell activity has not been sufficiently researched and so, to investigate the potential of this natural material for promoting osteoblastogenesis, we studied the activity of Locusta migratoria ethanol extract (LME) on MG-63 pre-osteoblast cells. The cytotoxicity and proliferation effects of LME on MG-63 cells were measured by MTS assay, and there was no cytotoxicity up to $1,000{\mu}g/ml$. With LME treatment of 500 and $1,000{\mu}g/ml$ for 48 hr, cell proliferation increased to 105% and 116% versus control, respectively. The osteoblastogenic activity of the LME was measured through alkaline phosphatase (ALP) staining at three and five days. As a result, both 500 and $1,000{\mu}g/ml$ LME concentrations were seen to increase ALP activity by more than three times compared with control at three and five days. In addition, the expression level of the osteogenic markers ALP and RUNX2 was markedly increased after LME treatment. These results demonstrate that Locusta migratoria ethanol extract promotes osteoblastogenesis as evidenced by the increased osteogenic markers and suggest that LME may be a potential agent for bone formation and osteoporosis prevention.
Insects have been investigated as a novel source of food and biomaterial in several recent studies. However, their osteoblastogenic cell activity has not been sufficiently researched and so, to investigate the potential of this natural material for promoting osteoblastogenesis, we studied the activity of Locusta migratoria ethanol extract (LME) on MG-63 pre-osteoblast cells. The cytotoxicity and proliferation effects of LME on MG-63 cells were measured by MTS assay, and there was no cytotoxicity up to $1,000{\mu}g/ml$. With LME treatment of 500 and $1,000{\mu}g/ml$ for 48 hr, cell proliferation increased to 105% and 116% versus control, respectively. The osteoblastogenic activity of the LME was measured through alkaline phosphatase (ALP) staining at three and five days. As a result, both 500 and $1,000{\mu}g/ml$ LME concentrations were seen to increase ALP activity by more than three times compared with control at three and five days. In addition, the expression level of the osteogenic markers ALP and RUNX2 was markedly increased after LME treatment. These results demonstrate that Locusta migratoria ethanol extract promotes osteoblastogenesis as evidenced by the increased osteogenic markers and suggest that LME may be a potential agent for bone formation and osteoporosis prevention.
현재까지 풀무치를 이용한 연구로는 집단형 풀무치에 대한 방제 연구[21], 국내 풀무치의 계통 분석[17], 풀무치 유래 펩타이드 및 GST의 구조 및 기능 분석[23, 27] 등이 진행되었으나 풀무치를 식·약용 소재로써 이용하기 위한 연구로는 풀무치 물 추출물을 이용하여 유전독성을 확인한 것이 유일하다[33]. 따라서 본 연구에서는 풀무치 추출물이 MG-63 조골세포 증식 및 활성에 미치는 영향을 분석하고자 하였으며, 이를 통해 풀무치 추출물의 골다공증 개선 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
염기성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)는 거의 모든 조직에 분포하며 특히 골 조직에서는 골 성장이 일어날때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다[3]. 따라서 조골세포의 활성을 나타내는 표지인자로써 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하여 풀무치 추출물이 조골세포의 골 성장 및 골세포 분화 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
대상 데이터
조골세포(human osteoblast-like cell, MG-63)는 ATCC (VA, USA)에서 구입하였으며 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, UT, USA)와 1× penicillin-streptomycin (Hyclone)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Hyclone)을 사용하여 배양하였고 세포는 37℃, 5% CO2 의 배양조건을 유지하였다. 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 계대 배양하며 실험을 진행하였다.
풀무치 추출물 제조
본 연구에 사용된 풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과 학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육한 해남 6세대를 사용하였다. 실험 곤충은 밀을 먹이로 사용하였으며 30℃, 65% R.
데이터처리
모든 실험 결과는 3회 반복하여 평균과 표준편차(mean± SD)로 나타냈다. 실험군 간의 유의성은 Student’s t-test를 통해 검정하였고, p<0.05일 때 군 간의 차이가 유의적인 것으로 판단하였다.
성능/효과
이는 RUNX2의 발현은 ascorbic acid로부터 영향을 받지 않는 이전의 연구에 부합하는 결과인 것으로 판단된다[35]. 단백질 발현량의 측정 결과에 따라 풀무치 추출물은 MG-63 조골세포에서 ALP 및 RUNX2의 단백질 발현을 증가시키며 이를 통해 MG-63 조골세포의 분화를 촉진하고 골 형성 기능을 가지며 결과적으로 골다공증 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
CTR 군에 비해 DM군과 LME 처리군에서 푸른색이 더욱 진하게 나타났으며 LME 처리 시 농도 의존적으로 진하게 염색되었다. 따라서 풀무치 추출물은 MG-63 조골세포의 ALP 활성을 증가시키며 이에 따라 조골세포의 분화가 증가하였음을 확인하였고, 골 성장 촉진에 도움을 줄 수 있는 소재로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
조골세포의 역할은?
조골세포는 골수의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 로부터 기원한 것으로, 지방세포, 근원세포, 연골세포 및 섬유 아세포로 분화되기도 한다[29]. 조골세포는 뼈의 세포 외 기질을 합성하고 칼슘 침착 및 미네랄화를 조절하며 기계적 자극에 반응하는 기능을 함으로써 뼈의 형성 및 재형성 과정에서 가장 중요한 역할을 한다[12, 16]. 따라서 골다공증 예방 및 치료 소재 개발을 위해서는 조골세포를 이용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
조골세포의 세포막에 존재하는 당단백 효소인 ALP의 특징은?
따라서 골다공증 예방 및 치료 소재 개발을 위해서는 조골세포를 이용한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 조골세포는 골의 표면에 근접해 분포하며 세포질 내에는 과립형질 내 세망이 발달하였고, 세포막에는 당단백 효소인 alkaline phosphatase (ALP)가 존재하는데 이효소는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내고, 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포분열 및 분화의 조절자로서 세포의 외막과 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 발견이 되며 이를 통해 골세포 분화의 표지인자로 사용되고 있다[13, 14, 32].
풀무치 추출물이 MG-63 조골세포 증식 및 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 ALP의 활성 및 조골세포의 분화 정도를 ALP staining의 염색 정도를 통해 확인하는 과정은?
ALP (염기성 인산 분해 효소) 활성 및 조골세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 ALP staining을 통해 염색 정도를 확인 하였다. MG-63세포를 96-well plate (SPL life sciences)에 1.5× 104 cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, 농도별 풀무치 추출물(50, 100, 500, 1,000 μg/ml) 및 조골세포 분화배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 배양하였다.배양된 세포는 PBS (Caisson laboratories)로 세척하였고 10% formalin (Biosesang, Korea)을 사용하여 세포를 고정한 후, BCIP/NBT substrate solution (Sigma)을 분주하여 빛이 없는 조건에서 1-2시간 동안 방치하였다. 세포에 푸르게 염색된 정도를 통해 조골세포의 분화 및 ALP 활성을 확인하였다.
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