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문제 정의
- 결론적으로, 본 연구에서는 합성이 용이한 AFP37 펩타이드의 N-말단 조각을 합성하고 이량체화 함으로써 활성이 높은 결빙방지 펩타이드를 설계하고자 하였지만 높은 활성을 얻지는 못하였다. 하지만 본 연구를 통해 결빙방지 펩타이드 설계 및 다량체화시 연결된 펩타이드의 얼음 결합 잔기들의 배향을 우선적으로 고려하여야 함을 보여주었다.
가설 설정
- 본 연구에서는 첫 12개 잔기를 포함한 15번 잔기와 21번 잔기까지 연장한 두 펩타이드를 제조, 이들의 이량체화를 시도하여 나선구조 함량과 온도 이력 활성을 측정하였다. 화학적으로 합성이 용이하며 상대적으로 높은 활성을 가진 작은 크기의 결빙방지 펩타이드(AFP12)를 이량체화 한다면 기존의 AFP37보다 활성이 높은 결빙방지 펩타이드를 개발할 수 있을 것이라는 가설 하에 실험을 수행하였다. 특히 이량체화를 시도한 이유는 결빙방지 펩타이드의 분자 크기가 클수록 결빙방지 펩타이드와 얼음간의 결합 면적이 증가함으로써 결빙방지 활성이 증가한다는 보고가 있기 때문이다[23, 24].
제안 방법
- Crude peptide는 0.05% trifluoroacetic acid (TFA)을 포함하는 water-acetonitrile gradient (0-80%)을 이동상으로 C18 Vydac column (15 mm, 20 mm × 250 mm)에서 역상크로마토그래피 (reverse-phase high-performance liquid chromatography: RP-HPLC)로 정제하였다.
- 단량체 펩타이드인 AFP15, AFP15N, AFP21, AFP21N은 Fmoc-기반의 고상합성법(solid phase peptide synthesis (SPPS))으로 수행하였다. DCC(dicyclohexylcarbodiimide)와 HOBt (Nhydroxybenzotriazole)를 coupling agent로 사용하였으며, 매회의 Fmoc-L-amino acids의 coupling에는 10당량의 Fmoc-L-amino acids를 사용하였다. Fmoc-보호기는 20% piperidine/N-methylpyrolidone(NMP) 용액으로 제거하였다.
- 결빙방지 펩타이드의 2차 구조 분석은 Jsaco사의 J-715 CD spectrophotometer (Toky, Japan)를 이용하여 수행하였다. 펩타이드 시료는 0.
- 결빙방지 펩타이드의 온도 이력 활성과 얼음결정 형태 측정은 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer, Otago osmometers, New Zealand)를 사용하여 측정하였다. 나노리터 삼투압계에 연결된 cold-well stage는 광학현미경으로 관찰하였으며 현미경에 탑재된 디지털 카메라로 얼음결정의 형태 변화를 기록하였다.
- 결빙방지 펩타이드의 온도 이력 활성과 얼음결정 형태 측정은 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer, Otago osmometers, New Zealand)를 사용하여 측정하였다. 나노리터 삼투압계에 연결된 cold-well stage는 광학현미경으로 관찰하였으며 현미경에 탑재된 디지털 카메라로 얼음결정의 형태 변화를 기록하였다. 사용한 시료는 0.
- 이 때의 온도가 해당 용액의 녹는점이 된다. 다시 온도를 0.05℃/min로 천천히 내리면서 단일 얼음결정의 형태 변화를 관찰하였다. 결빙방지 단백질이 포함된 경우 온도가 하강해도 얼음 결정이 커지지 않고 일정한 온도까지 유지되다가 어는점에 도달하면 급격히 결정이 성장하는 하게 된다.
- 본 연구에서는 AFP 37의 N-말단 12잔기와 C-말단 3 잔기인TAR을 연결한 AFP15과 N-말단 18잔기와 C-말단 3 잔기인TAR을 연결한 AFP21 를 합성하였다(Table 1). AFP15는 야생형 AFP37과 유사하게 나선구조의 N-말단과 C-말단에 capping을 가질 것으로 예상할 수 있다[29].
- 본 연구에서는 첫 12개 잔기를 포함한 15번 잔기와 21번 잔기까지 연장한 두 펩타이드를 제조, 이들의 이량체화를 시도하여 나선구조 함량과 온도 이력 활성을 측정하였다. 화학적으로 합성이 용이하며 상대적으로 높은 활성을 가진 작은 크기의 결빙방지 펩타이드(AFP12)를 이량체화 한다면 기존의 AFP37보다 활성이 높은 결빙방지 펩타이드를 개발할 수 있을 것이라는 가설 하에 실험을 수행하였다.
- 5 mm, 20 mm × 250 mm)으로 펩타이드의 순도를 확인하였다. 이량체 펩타이드인 dAFP15N과 dAFP21N은 앞서 합성한 단량체 펩타이드를 10% DMSO/ acetic acid에서 48시간 반응시켜서 합성하였다. 이황화 결합된 이량체 펩타이드를 RP-HPLC를 이용하여 정제하였다.
- 이량체 펩타이드인 dAFP15N과 dAFP21N은 앞서 합성한 단량체 펩타이드를 10% DMSO/ acetic acid에서 48시간 반응시켜서 합성하였다. 이황화 결합된 이량체 펩타이드를 RP-HPLC를 이용하여 정제하였다. 정제가 완료된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) (Shimadzu, Japan)로 펩타이드의 분자량을 확인하였다.
- 야생형AFP37의 경우 C-말단이 amidation화 되어 있으나 본 연구에서 합성한 AFP15의 경우 그렇지 못하므로 펩타이드의 나선구조 안정화가 약할 것이라고 추측할 수 있다. 이황화 결합을 통한 AFP15이량체를 제조하기 위하여 CGG서열을 N-말단에 도입하여 AFP15N을 합성하였다. 이황화 결합의 형성을 높이기 위하여 flexibility가 높은 Gly잔기를 N-말단에 2 개 도입하였다.
- 이황화 결합을 통한 AFP15이량체를 제조하기 위하여 CGG서열을 N-말단에 도입하여 AFP15N을 합성하였다. 이황화 결합의 형성을 높이기 위하여 flexibility가 높은 Gly잔기를 N-말단에 2 개 도입하였다. 마찬가지 방법으로 AFP21N 을 제조하였다.
- 이황화 결합된 이량체 펩타이드를 RP-HPLC를 이용하여 정제하였다. 정제가 완료된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) (Shimadzu, Japan)로 펩타이드의 분자량을 확인하였다. 대조구로 AFP37을 사용하였다.
- 정제가 완료된 펩타이드는 분석용 C18 Vydac column (4.5 mm, 20 mm × 250 mm)으로 펩타이드의 순도를 확인하였다.
- 제조한 펩타이드의 2차 구조를 circular dichroism (CD) spectrophotomer로 분석하였다(Fig. 2). 펩타이드 α-나선 구조는 주로 208과 222 nm의 파장에서 음의 값을 가진 CD 스펙트럼을 보여준다.
- 5)에 100 μg/ml이 되도록 녹인 후 사용하였다. 준비한 시료는 quartz cuvette (1-mm path length)에 넣고 25℃에서, 190-250 nm 범위의 far-UV에서 circular dichroism spectra를 측정하였다. 펩타이드의 CD spectra는 molar ellipticity [θ] vs 파장의 그래프로 나타냈다.
- 이 well을 cold-well stage에 올려놓고 -20℃로 급속 냉동시킨 후 약 10여분간 온도를 유지하였다. 천천히 온도를 상승시키면서 얼음을 관찰하였다. 단일 얼음결정의 얼음이 거의 다 녹을 때까지 온도를 올린다.
대상 데이터
- 정제가 완료된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) (Shimadzu, Japan)로 펩타이드의 분자량을 확인하였다. 대조구로 AFP37을 사용하였다.
- 1D) [11]. 본 연구에서 설계한 펩타이드의 경우 CD 스펙트럼과 온도 이력 활성을 통해볼 때 얼음과 강한 결합을 하지 못할 것으로 예상되는데, Fig. 3C에 제시한 바와 같이 각 펩타이드는 얼음과 결합에 의한 얼음 결정의 모양은 육각기둥 형태 또는 별 모양이었다. 야생형 AFP37와 같은 쌍피라미드 형태의 얼음 결정은 다소 강한 얼음-펩타이드 결합을 나타내지만 육각기둥 또는 별 모양은 약한 얼음-펩타이드 결합을 나타낸다.
- 나노리터 삼투압계에 연결된 cold-well stage는 광학현미경으로 관찰하였으며 현미경에 탑재된 디지털 카메라로 얼음결정의 형태 변화를 기록하였다. 사용한 시료는 0.1 M NH4HCO3, pH 8.5에 녹인 후 사용하였다. 수 μl 부피의 시료 well에 immersion oil을 채운 후 측정 대상 시료 약 1.
이론/모형
- 합성 결빙방지 펩타이드를 제조하기 위하여 사용한 아미노산 서열은 Table 1에 나타내었다. 단량체 펩타이드인 AFP15, AFP15N, AFP21, AFP21N은 Fmoc-기반의 고상합성법(solid phase peptide synthesis (SPPS))으로 수행하였다. DCC(dicyclohexylcarbodiimide)와 HOBt (Nhydroxybenzotriazole)를 coupling agent로 사용하였으며, 매회의 Fmoc-L-amino acids의 coupling에는 10당량의 Fmoc-L-amino acids를 사용하였다.
성능/효과
- AFP15와 AFP21의 경우 C-말단의 Arg 잔기가 AFP37과 달리 amidation 되지 않아 전체적으로 펩타이드의 유연성이 증가하였을 가능성이 높다. N-말단에 CGG 잔기가 도입된 AFP15N과 AFP21N의 경우 모두 나선 구조 함량이 각각 AFP15와 AFP21에 비해 더 떨어진 것으로 나타났다. 이는 N-말단에 도입된 잔기가 펩타이드의 유연성을 증가시킴과 동시에 N-말단의 capping 잔기로서 역할을 하지 못하기 때문인 것을 여겨진다.
- 즉 이량체 펩타이드가 하나의 30-mer 또는 42-mer로 작용하기 보다 두 개의 15-mer와 21-mer로 작용하며 이들의 얼음 결합 잔기들이 같은 배향을 하지 않은 것으로 볼 수 있다. 온도 이력 활성 결과를 볼 때, 하나의 이량체에 두 개의 개별적인 얼음 결합 펩타이드가 동시에 얼음과 결합하지 못하는 것으로 판단된다. 따라서 향후 결빙방지 펩타이드 이량체 설계시 이러한 점을 고려하여야 할 것이다.
- 3A과 B). 이량체화된 dAFP15N은 AFP15보다 상대적으로 높은 활성을 보였다. 이는 이황화 결합으로 인한 펩타이드의 자유도가 낮아짐으로써 나선 구조 함량이 증가했기 때문으로 추론할 수 있다.
- 2에 나타낸 바와 같이 AFP37은 전형적인 나선 구조의 CD 스펙트럼을 보이는 반면, 본 연구에서 제작한 펩타이드는 다소 나선 구조 함량이 적은 CD 스펙트럼을 보였다. 특히 N-말단에 CGG를 도입한 두 펩타이드 AFP15N과 AFP21N의 나선 구조 함량이 가장 낮은 것으로 나타났다. AFP21은 AFP15보다 나선 구조 함량이 다소 높게 나타났다.
후속연구
- 온도 이력 활성 결과를 볼 때, 하나의 이량체에 두 개의 개별적인 얼음 결합 펩타이드가 동시에 얼음과 결합하지 못하는 것으로 판단된다. 따라서 향후 결빙방지 펩타이드 이량체 설계시 이러한 점을 고려하여야 할 것이다.
- 결론적으로, 본 연구에서는 합성이 용이한 AFP37 펩타이드의 N-말단 조각을 합성하고 이량체화 함으로써 활성이 높은 결빙방지 펩타이드를 설계하고자 하였지만 높은 활성을 얻지는 못하였다. 하지만 본 연구를 통해 결빙방지 펩타이드 설계 및 다량체화시 연결된 펩타이드의 얼음 결합 잔기들의 배향을 우선적으로 고려하여야 함을 보여주었다. 향후 결빙방지 펩타이드와 그 유도체 등의 개발시 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.
- 하지만 본 연구를 통해 결빙방지 펩타이드 설계 및 다량체화시 연결된 펩타이드의 얼음 결합 잔기들의 배향을 우선적으로 고려하여야 함을 보여주었다. 향후 결빙방지 펩타이드와 그 유도체 등의 개발시 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.
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