[논문]C2C12 근아세포의 산화적 손상에 대한 고삼, 감초 및 백선피 복합 추출물의 보호효과

최은옥; 황보현; 김민영; 손다희; 정진우; 박철; 홍수현; 김민주; 이지영; 신수진; 최영현

doi:10.14374/hfs.2017.25.2.179

C2C12 근아세포의 산화적 손상에 대한 고삼, 감초 및 백선피 복합 추출물의 보호효과
Protective Effects of Ethanol Extract Mixtures of Sophora flavescens, Glycyrrhiza uralensis and Dictamnus dasycarpus against Oxidative Stress-induced Damage in C2C12 Murine Myoblasts 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.25 no.2, 2017년, pp.179 - 191

최은옥 (동의대학교 항노화연구소) , 황보현 (동의대학교 항노화연구소) , 김민영 (동의대학교 항노화연구소) , 손다희 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 정진우 (동의대학교 항노화연구소) , 박철 (동의대학교 자연생활과학대학 분자생물학과) , 홍수현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 김민주 ((주)리오엘리) , 이지영 ((주)리오엘리) , 신수진 ((주)리오엘리) , 최영현 (동의대학교 항노화연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Increased oxidative stress by reactive oxygen species (ROS) has been suggested as a major cause of muscle fatigue. Although several studies have demonstrated the various biological properties of Sophora flavescens Aiton, Glycyrrhiza uralensis Fischer and Dictamnus dasycarpus Turcz, but the antioxidative potentials have not been clearly demonstrated. The present study was designed to investigate the protective effects of their water and ethanol extract mixtures (medicinal herbal mixtures, MHMIXs) on hydrogen peroxide ($H_2O_2$)-induced cell damage and apoptosis in C2C12 myoblasts. Methods : Cytotoxicity was assessed by an MTT assay. Quantitative evaluation of apoptosis induction and ROS production was evaluated by flow cytometry analysis. Expression levels of apoptosis regulatory and DNA-damage proteins were detected by Western blotting. Result : The inhibition of $H_2O_2$-induced cell proliferation was effectively blocked in extracts of 3: 1: 1 (EMHMIXs-1) or 2: 2: 1 (EMHMIXs-2) of S. flavescens, G. uralensis and D. dasycarpus Turcz, ethanol extracts from various complex extracts in C2C12 myoblasts. EMHMIXs-1 and EMHMIXs-2 also effectively attenuated $H_2O_2$-induced C2C12 cell apoptosis, which was associated with the restoration of the upregulation of Bad and death receptor 4, and downregulation of XIAP and cIAP-1 induced by $H_2O_2$. In addition, these herbal mixtures significantly blocked the $H_2O_2$-induced ROS generation and phosphorylation of $p-{\gamma}H2A.X$, which suggests that they can prevent $H_2O_2$-induced cellular DNA damage. Conclusions : The results suggest that EMHMIXs-1 and EMHMIXs-2 could block the DAN damage and apoptosis of C2C12 myoblasts by oxidative stress through blocking ROS generation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

또한, lipopolysaccharide (LPS)로 자 극된 대식세포에서 항염증 효과를 검증하기 위하여 실시한 일산화질소(nitric oxide, NO) 및 염증성 cytokine의 생성량과 이들 조절 유전자들의 발현 변화 조사에서도 고삼, 감초 및 백선피 추출물이 3:1:1 로 혼합된 복합 추출물 처리군에서 한약재 단일 추출물의 함량에 비해 각각의 한약재 단일 추출물의 함량이 낮음에 비하여 더 효과적이거나 유사한 결과를 얻었다¹⁸⁾ . 따라서 본 연구에서는 복합 처리 시 상승효과를 볼 수 있을 것으로 기대되는 고삼, 감초 및 백선피 의 각 열수 및 에탄올 추출물의 혼합 비율을 달리한 복합 추출물(medicinal herber mixtures, MHMIXs)을 이용하여 안전하면서 산화적인 스트레스에 대한 보호효능이 우수한 혼합의 비율을 발굴하고자 하였다. 이를 위하여 C2C12 세포를 이용하여 H₂O₂로 유도된 산화적 손상의 차단효과를 다양한 지표를 통하여 평가하였다.

제안 방법

. 이는 아마도 단일 추출물 각 함유 성분들의 효능이 더 복합적으로 나타난 현상일 것 으로 추측되며, 본 연구에서는 C2C12 세포 모델을 대상으로 H₂O₂에 의하여 유발된 산화적 손상에서 복합 처리 시 상승효과를 볼 수 있을 것으로 기대되는 3가지 한약재의 열수 및 에탄올 추출물의 혼합비율을 달리한 복합 추출물(medicinal herber mixtures, MHMIXs) 을 전처리하였을 경우 나타나는 세포 보호효과를 통한 산화적 손상 억제 효능을 평가하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 C2C12 근아세포, HaCaT 피부각질세포, C6 신경교세포는 American Type Culture Collection (Manassas, MD, USA)에서 분양받았으며, 세포의 배양을 위해 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, WELGENE, Daegu, Republic of Korea) 및 1%의 penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, WELGENE)을 사용하여, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 매 48 시간마다 0.
본 연구에 사용된 고삼, 감초 및 백선피는 ㈜서경한 방약업사(Busan, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였다. 고삼 열수 추출물(water extract of S.

데이터처리

시료로부터 얻어진 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 이때 사용한 모든 통 계분석은 SPSS 17.

성능/효과

이를 확인하기 위해 C2C12 세포에서 H₂O₂에 대한 복합 추출물의 생존율 억제 차단 효과와 apoptosis 및 DNA 손상 억제 그리고 ROS 생성 억제 여부 등을 확인하였다. 그 결과, 복합 추출물 중 EMHMIX-1와 EMHMIX-2를 전처리하였을 때 H₂O₂에 의한 세포생존율 저해가 회복되었고 H₂O₂로 유발된 apoptosis도 현저히 감소되었다. 이러한 현상은 Bad, DR4, XIAP, cIAP-1, γH2A.
X와 같은 apoptosis 및 DNA 손상 관련 단백질의 발현 변화 억제와 연관성이 있었다. 또한 H₂O₂에 의해 세포 내 증가된 ROS가 EMHMIX-1와 EMHMIX-2의 전처리에 의해 감소되어 EMHMIX-1 와 EMHMIX-2의 이러한 산화적 스트레스에 대한 보호 효과와 DNA 손상 억제 및 apoptosis 억제 효능은 ROS 생성 억제를 통해 일어남을 확인 할 수 있었다.
따라서 XIAP와 cIAP-1의 유전자의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과 EMHMIX-1와 EMHMIX-2는 H₂O₂로 감소된 XIAP와 cIAP-1의 발현 증가를 유의적으로 증가시켰다(Fig 3C 및 D). 이러한 결과로서 EMHMIX-1와 EMHMIX-2에 의한 C2C12 세포의 apoptosis 보호 효과는 extrinsic 및 intrinsic pathway 유전자 발현의 동시 조절과 연관성이 있음을 알 수 있었다.

후속연구

3A 및 B). 열수 추출물보다 에탄올 추출물이 산화적 스트레스에 대한 보호 효과가 뛰어난 것은 아 마도 단순 열수보다도 에탄올에 의하여 더 다양한 물질들이 침출되어 나오기 때문이라 생각하며, 이에 대한 추가적인 지표 물질을 포함한 성분 분석이 요구된다.
6 의 결과에서 알 수 있듯이 C2C12와 HaCaT 세포에서 3가지 단일 추출물 및 4가지 복합 추출물이 모두 약 95% 이상의 생존율을 유지하였다. 하지만 C6 세포에 서는 오히려 세포증식을 유도하여 최고농도(1 mg/ml)에서는 150% 이상의 세포증식이 나타나 세포 성장을 촉진시키는 작용을 하는 것으로 생각되며 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이를 통하여 C2C12 세포에서 산화적인 스트레스로 인해 유도되는 apoptosis와 DNA 손상에 대해 보호효과를 나타낸 EMHMIX-1과 EMHMIX-2는 세포독성이 없는 범위에서 산화적 스트레스를 차단할 수 있음을 재확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	활성산소종은 무엇인가?	활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 미토콘드리아 내에서 발생하는 산소의 환원 대사산물로서, 과도한 스트레스, 방사선 및 화학물질 등에 노출되거나 항산화 시스템의 기능이 저하되어 체내 산화환원 대사의 균형이 파괴될 경우 비정상적으로 생성될 수 있다. 증가된 ROS에 의해 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유도되면 세포 내 DNA, 단백 질, 지질의 심한 손상이 초래된다1-3) .
	활성산소종은 어떻게 발생되는가?	활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 미토콘드리아 내에서 발생하는 산소의 환원 대사산물로서, 과도한 스트레스, 방사선 및 화학물질 등에 노출되거나 항산화 시스템의 기능이 저하되어 체내 산화환원 대사의 균형이 파괴될 경우 비정상적으로 생성될 수 있다. 증가된 ROS에 의해 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유도되면 세포 내 DNA, 단백 질, 지질의 심한 손상이 초래된다1-3) .
	증가된 활성산소종은 어떤 손상을 초래하는가?	활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 미토콘드리아 내에서 발생하는 산소의 환원 대사산물로서, 과도한 스트레스, 방사선 및 화학물질 등에 노출되거나 항산화 시스템의 기능이 저하되어 체내 산화환원 대사의 균형이 파괴될 경우 비정상적으로 생성될 수 있다. 증가된 ROS에 의해 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유도되면 세포 내 DNA, 단백 질, 지질의 심한 손상이 초래된다1-3) . 이러한 산화적 스트레스 및 ROS는 다양한 기전을 통하여 노화, 세포의 돌연변이, 뇌질환, 심장질환, 동맥경화 등 다양 한 질병의 발생과 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있다 4-6).

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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