[논문]식이성 폴리페놀 (-)-epigallocatechin-3-gallate가 mouse C2C12 myoblast 분화에 미치는 영향

김혜진; 이원준

doi:10.5352/jls.2007.17.3.420

식이성 폴리페놀 (-)-epigallocatechin-3-gallate가 mouse C2C12 myoblast 분화에 미치는 영향
Effects of dietary polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate on the differentiation of mouse C2C12 myoblasts 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.17 no.3 = no.83, 2007년, pp.420 - 426

김혜진 (이화여자대학교 건강과학대학 체육과학과) , 이원준 (이화여자대학교 건강과학대학 체육과학과)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 하는 DNA 메틸화를 식이성 폴리페놀의 하나인 녹차의 대표적인 추출물 EGCG로 억제하였을 때 C2C12 myoblast 세포에 일어나는 현상을 살펴보았다. 그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle ${\alpha}-actin$ mRNA와 단백질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다. 식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달 역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다. 따라서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the present investigation, we studied the modulating effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG) on the differentiation of mouse C2C12 myoblasts. We found that the strong inhibitory effect of EGCG on DNA methyltransferase-mediated DNA methylation induced transdifferentiation of C2C12 myoblasts into smooth muscle cells demonstrated by both morphological changes and immunofluorescent staining. C2C12 myoblasts treated with EGCG for 4 days expressed smooth muscle ${\alpha}-actin$ protein. Real-time PCR data revealed that smooth muscle ${\alpha}-actin$ mRNA was induced by EGCG treated C2C12 myoblasts in a concentration-dependent manner. Smooth muscle ${\alpha}-actin$ mRNA concentration increased 330% and 490% after 2 and 3 days of 50 ${\mu}M$ of EGCG treatment. The expression of another smooth muscle marker, transgelin, mRNA was also increased up to 9-fold by 4 days of EGCG treatment compared with control in a concentration-dependent manner. These results suggested that C2C12 enables to transdifferentiate into smooth muscle when gene expression patterns are changed by the inhibition of DNA methylation induced by EGCG. In conclusion, transdifferentiation of C2C12 myoblasts into smooth muscle is resulted from the modulating effects of EGCG on DNA methylation which subsequently results in changing the expression pattern of several genes playing a critical role in the differentiation of C2C12 myoblasts.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

EGCG는 암세포의 증식에 관련된 유전자의 발현을 조절함으로써 암세포의 증식을 억제하는데 매우 효력이 있는 것으로 알려지고 있지만, 식이성 EGCG 폴리페놀이 골격근 C₂C₁₂ myoblast 세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구의 목적은 녹차에서 추출된 폴리페놀 EGCG가 C₂C₁₂ myoblast 세포 분화에 미치는 영향을 조사하였다.
staining을 통해 입증하였다. 본 연구에서는 더 나아가 EGCG가 smooth muscle a-actin mRNA의 발현에 어떠한 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해 smooth muscle a-actin primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다(Fig. 5). EGCG의 농도가 낮을 때(3.
본 연구에서는 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 하는 DNA 메틸화를 식이성 폴리페놀의 하나인 녹차의 대표적인 추출물 EGCG로 억제하였을 때 C₂C₁₂ myoblast 세포에 일어나는 현상을 살펴보았다. 그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle a-actin mRNA와 단백 질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다.
즉, 세포의 형태, 핵의 수, smooth muscle a-actin의 발현을 종합해 볼 때 EGCG가 C₂C₁₂ myo- bla아 세포를 smooth muscle로 분화시킴을 검증할 수 있었다. 본 연구에서는 한층 더 나아가 smooth musde의 marker 인 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 변화를 살펴보았다. 그 결과 4일간의 EGCG를 처리한 C₂C₁₂ myoblasts 세포에서 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 발현이 최대 약 9배와 5배 정도 각각 대'조군에 비해 증가함을 나타냈다.

가설 설정

이와 같이 많은 폴리페놀 중 EGCG의 독특한 화학구조가 DNA 메틸화를 억제하는데 있어서 중요한 역할을 하며, 이로 인해 많은 연구들이 암 예방 차원에서 EGCG의 효능을 연구하는 주된 이유가 되고 있다. 이러한 강력한 EGCG의 DNA 메틸화 억제작용이 암세포에서 여러가지 유전자의 발현을 조절하듯이 암세포가 아닌 C₂C₁₂ myoblast 세포의 분화와 관련 유전자 발현에 영향을 미칠 것이라는 가설아래 본 연구에서는 최대 50 μM 의 EGCG를 4일 동안 mouse C₂C₁₂ myoblast 세포에 처리하였다.

제안 방법

4일간의 EGCG 처리가 C₂C₁₂ myoblast 세포를 형태적 관점에서 보았을 때 smooth muscle의 형태로 변화시켰으며, 이러한 결과를 분자적으로 검증하기 위하여 smooth muscle 의 지표로 널리 알려진 smooth muscle a-actin 단백질의 발현 정도를 immunofluorescent staining 방법을 이용하여 알아보았다. Fig.
C₂C₁₂ myoblast 세포를 6 wells 배양 plate에 고정(fix) 시키 기 위하여 3.7 % formaldehyde (pH 7-8)를 함유하고 있는 PBS 1ml를 각각의 well에 10분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 fix된 세포를 씻어낸 후 0.
배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다. EGCG 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle a-actin과 transgelin mRNA의 변화를 알아보기 위하여 C₂C₁₂ 세포를 분주한 뒤 24시간 후 50 μM의 EGCG를 0, 24, 48, 72시 간 동안 처리하였다.
본 실험에서 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타난 바와 같다. SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(Perkin Elmer, Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며' 각각의 target mRNA의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate de- hydrogenase(GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.
Transgelin(smooth muscle 22 protein)과 smooth muscle a-actin messenger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, double-stranded DNA dye 인 SYBR Green (Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다. 본 실험에서 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타난 바와 같다.
대조군과 EGCG로 처리된 세포를 TRIzol reagent(Life Technologies, Grand Island, NY)를 각 well당 600 μ1 넣은 후 total RNA를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen/ Valencia, CA)을 이용하여 얻었다. 추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 UV 260 nm에서 농도를 측정하였다.
있다. 따라서 C₂C₁₂ myoblast 세포에 EGCG를 4일간 처리한 후 smooth muscle marker인 transgelin mRNA에 어떠한 변화가 일어났는지를 real-time PCR을 이용하여 살펴보기 위하여 세포를 6 wells plate에 1X10, 으로 분주를 한 후 24시간 후 EGCG를 대조군에는 처리하지 않았으며, EGCG 처리 군에는 각각 다른 농도(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μM)로서 4일간 처리하였다. 그 결과 EGCG로 4일간 처리한 세포에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하였을 때 농도 의존적으로 증가함을 보여준다(Fig.
다음 세포는 PBS로 3번 씻은 후 1:250 비율로 희석된 Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG secondary 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR)로 상온에서 30분간 더 배양하였다. 마지막 단계로서 세포를 PBS로 3번 헹군 후 핵의 변화를 살펴보기 위하여 1.5μg/md의 4', 6-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 staging한 후 PBS로 3번 헹구어 내었다. 세포 배양 plate 상에서의 smooth muscle a-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 system을 갖춘 Axiovert 200 epifluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
5, 25, 50 μM) 의 EGCG를 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다. EGCG 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle a-actin과 transgelin mRNA의 변화를 알아보기 위하여 C₂C₁₂ 세포를 분주한 뒤 24시간 후 50 μM의 EGCG를 0, 24, 48, 72시 간 동안 처리하였다.
본 실험에서 사용한 EGCG의 농도 중 최고 농도인 50 μM의 EGCG를 4일간 처 리하자 transgelin mRNA 발현이 약 9배정도 유의하게 증가되었다. 본 실험의 mRNA 결과는 real-time PCR을 실시할 때 각각 샘플의 cDNA copy 수를 보정하기 위하여 transgelin mRNA 발현 정도를 각 샘플의 GAPDH mRNA로 보정하였다.
2의 b에서 보듯이 대조군에서는 핵의 숫자가 EGCG 처리된 세포에 비해 그 수와 밀도가 많이 증가하였음을 알 수 있다. 본 연구에서는 서론에서 언급하였듯이 C₂C₁₂ 세포를 분화배지 조건에서 배양을 하지 않고, 10% FBS 상태에서 EGCG를 처리하였다. 따라서 핵의 숫자가 EGCG 처리군에 비해 대조군에서 확연히 높다는 것은 EGCG가 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다고 사료된다.
5μg/md의 4', 6-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 staging한 후 PBS로 3번 헹구어 내었다. 세포 배양 plate 상에서의 smooth muscle a-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 system을 갖춘 Axiovert 200 epifluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
세포는 30 mm plate에 2 ml당 1x1(/ 세포를 분주하고 24시간 후 여러가지 농도 (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μM) 의 EGCG를 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다.
또한 세포를 분주한 후 4일이 지났음에도 불구하고 EGCG로 처리한 세포에서는 세포의 밀도가 대조군에 비해서 확연히 낮음을 볼 수 있다. 세포의 증식 정도를 좀 더 명확히 알기 위하여 DAPI로써 C₂C₁₂ myoblast 세포의 핵을 염색하였다. Fig.
시간의 변화에 따른 transgelin mRNA 발현 정도를 살펴보기 위하여 50 μM의 EGCG를 각각 24, 48, 72 시간 동안 C₂C₁₂ myoblast 세포에 처리한 후 transgelin mRNA 발현변화를 살펴보았다(Fig. 4). 50 μM의 EGCG을 24시간동안 세포에 처리한 결과 transgelin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 변화가 없었지만 48시간과 72시간동안 EGCG를 처리한 후에는 5-6배 가까이 유의하게 증가하였다.
앞에서 언급한 바와 같이 4일 동안 EGCG를 C₂C₁₂ myo- blast에 처리 후 smooth muscle a-actin 단백질이 발현됨을 immunofluorescent staining을 통해 입증하였다. 본 연구에서는 더 나아가 EGCG가 smooth muscle a-actin mRNA의 발현에 어떠한 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해 smooth muscle a-actin primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다(Fig.
CA)을 이용하여 얻었다. 추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 UV 260 nm에서 농도를 측정하였다. 그 다음 0.

대상 데이터

Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배 양 plate는 BioClone, Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, EGCG는 Sigma- Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.
Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배 양 plate는 BioClone, Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, EGCG는 Sigma- Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.

성능/효과

4). 50 μM의 EGCG을 24시간동안 세포에 처리한 결과 transgelin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 변화가 없었지만 48시간과 72시간동안 EGCG를 처리한 후에는 5-6배 가까이 유의하게 증가하였다.
본 연구에서는 한층 더 나아가 smooth musde의 marker 인 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 변화를 살펴보았다. 그 결과 4일간의 EGCG를 처리한 C₂C₁₂ myoblasts 세포에서 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 발현이 최대 약 9배와 5배 정도 각각 대'조군에 비해 증가함을 나타냈다. 시간적 인 개념으로 보았을 때 24시간 동안의 50 μM EGCG는 transgin과 smooth muscle a-actin mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으나, 50 μM의 EGCG를 48시간, 72시간동안 C₂C₁₂ myobla마 세포에 처리한 후 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA는 약 5-6배 정도 대조군에 비해 높게 발현됨을 나타내었다.
5, 25, 50 μM)로서 4일간 처리하였다. 그 결과 EGCG로 4일간 처리한 세포에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하였을 때 농도 의존적으로 증가함을 보여준다(Fig. 3). 가장 낮은 농도인 3.
현상을 살펴보았다. 그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle a-actin mRNA와 단백 질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다. 식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C₂C₁₂ myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다.
25 pM) C₂C₁₂ myobla아 세포에서 의 smooth muscle a-actin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 적은 폭이지만 유의하게 약 40% 정도 증가하였다. 농도가 점점 더 높아질수록 smooth muscle a-actin mRNA는 이에 비 례하여 증가하는 경향을 보였으며' 가장 높은 농도인 50 μM의 EGCG는 C₂C₁₂ myoblast 세포의 smooth muscle a-actin mRNA 발현을 약 4.5배정도 유의하게 증가시켰다.
다양한 농도의 EGCG를 C₂C₁₂ myoblast 세포에 4일간 처리 한 후 phase 상에서 의 사진을 관찰한 결과 형태학적 인 측면에서 C₂C₁₂ my oblast 가 EGCG 처리 후 smooth muscle 세포로 분화되는 것을 관찰하였다. 세포의 형태로 보았을 때 Fig.
Springer 등[23]은 C₂C₁₂ 골격근 myoblast 로부터 기인된 myotube에서 smooth muscle a-actin 단백질이 일시적으로 발현된다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 관찰된 smooth muscle a-actin의 발현으로서 smooth muscle 로 분화가 되었다고 단정하기는 어려울 것이라는 가능성을 배제할 수 없었다. 하지만 형태학적으로는 물론 골격근 my- 아미의 가장 큰 특징 증 하나인 다핵 (multinucleated)을 가진 세포 또한 관찰할 수 없었다.
smooth muscle a-actin을 발현하는 세포들에서 한 개 또는 두 개의 핵이 존재하였으며, 이러한 한 개 또는 두 개의 핵 수는 smooth muscle에서 나타나는 전형적인 특징 중 하나이다. 또한, 세포의 형태로 보았을 때 EGCG를 처리한 초기에는 길어지는 elongation 현상이 일어났으며, 시간이 점점 더 흐름에 따라 주위의 세포들과 fusion 현상이 일어나면서 형태가 매우 커지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 근육 myotube가 형성될 때에도 나타나지만, myotube 형성 시에는 굵지만 길고 긴 형태의 tube 모양이 일반적으로 나타난다.
5 μM의 EGCG로 처리된 C₂C₁₂ myoblast 세포에서는 148% 정도 중가치를 나타내었다. 본 실험에서 사용한 EGCG의 농도 중 최고 농도인 50 μM의 EGCG를 4일간 처 리하자 transgelin mRNA 발현이 약 9배정도 유의하게 증가되었다. 본 실험의 mRNA 결과는 real-time PCR을 실시할 때 각각 샘플의 cDNA copy 수를 보정하기 위하여 transgelin mRNA 발현 정도를 각 샘플의 GAPDH mRNA로 보정하였다.
시간에 따른 smooth muscle a-actin mRNA의 발현 변화를 보기 위하여 50 pM의 EGCG로 세포를 처리한 후 24, 48, 72 시간이 경과한 후 각 시점에서 mRNA 농도 변화를 살펴본 결과 transgelin mRNA 발현 변화와 비슷한 경향으로 증가하였으며, 72시간 처리 후에는 약 6배정도 대조군과 비교하였때 smooth muscle a-actin mRNA가 증가하였다(Fig. 6).
그 결과 4일간의 EGCG를 처리한 C₂C₁₂ myoblasts 세포에서 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 발현이 최대 약 9배와 5배 정도 각각 대'조군에 비해 증가함을 나타냈다. 시간적 인 개념으로 보았을 때 24시간 동안의 50 μM EGCG는 transgin과 smooth muscle a-actin mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으나, 50 μM의 EGCG를 48시간, 72시간동안 C₂C₁₂ myobla마 세포에 처리한 후 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA는 약 5-6배 정도 대조군에 비해 높게 발현됨을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때 식이성 폴리페놀인 EGCG가 mouse C₂C₁₂ myoblast 세포에서 중요한 후천적(epigenetic) 유전자 발현기전인 DNA 메틸화를 조절함으로써 골격근으로의 분화가 아닌 smooth muscle로의 분화를 유도함을 다시 한 번 검증할 수 있었다.
시간적 인 개념으로 보았을 때 24시간 동안의 50 μM EGCG는 transgin과 smooth muscle a-actin mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으나, 50 μM의 EGCG를 48시간, 72시간동안 C₂C₁₂ myobla마 세포에 처리한 후 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA는 약 5-6배 정도 대조군에 비해 높게 발현됨을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때 식이성 폴리페놀인 EGCG가 mouse C₂C₁₂ myoblast 세포에서 중요한 후천적(epigenetic) 유전자 발현기전인 DNA 메틸화를 조절함으로써 골격근으로의 분화가 아닌 smooth muscle로의 분화를 유도함을 다시 한 번 검증할 수 있었다.
단지 암세포에서의 DNA 메틸화가 가지는 기능뿐만 아니라 다른 세포에서의 DNA 메틸화의 중요성과 기능에 대한 연구에 대한 관심이 한층 고조되고 있다. 이러한 연구들에서 도출된 결론은 DNA 메틸화를 포함한 histone 메틸화, histone 아세틸화(acetylation)와 같은 후천적 기작이 세포 운명의 전환 (cell-fate conversion)에 중심적인 역할을 하는 기작이라는 것이다. 최근의 연구는 histone deacetylase 억제제인 valproic acid와 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-Z-deoxycytidine 가 골.
하지만 본 연구에서의 세포 형태는 일반적인 공통점을 찾기 어려울 만큼 다양한 형태의 세포가 형성되었다. 즉, 세포의 형태, 핵의 수, smooth muscle a-actin의 발현을 종합해 볼 때 EGCG가 C₂C₁₂ myo- bla아 세포를 smooth muscle로 분화시킴을 검증할 수 있었다. 본 연구에서는 한층 더 나아가 smooth musde의 marker 인 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 변화를 살펴보았다.

후속연구

본 연구는 C₂C₁₂ myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다. 따라서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 몇몇 학자들이 mouse embryonal carcinoma(pl9)세포, 신경관 줄기세포(neural crest stem cell), mouse embryonic 10T1/2 세포를 smooth muscle로 전이 분화(transdifferentiation)를 유도함으로써 초기 분화단계에 대한 기작연구를 수행하기에, 이르렀다[22]. 따라서 본 연구에서 보고한 mouse C₂C₁₂ 세포가 녹차 추출성분인 EGCG에 의해 smooth muscle로의 전이분화는 smooth mus- de의 형성과 분화초기의 연구에 있어서 훌륭한 시스템을 제공할 것으로 사료된다.
식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C₂C₁₂ myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 C₂C₁₂ myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다. 따라서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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