Objective : According to recent studies, Anemarrhenae Rhizoma has anti-inflammatory activities of DW extract, but it hasn't not yet conducted to evaluate inflammatory factors about 80% ethanol extract. Therefore, The aim of this study is to investigate the various effects of individual or combined 8...
Objective : According to recent studies, Anemarrhenae Rhizoma has anti-inflammatory activities of DW extract, but it hasn't not yet conducted to evaluate inflammatory factors about 80% ethanol extract. Therefore, The aim of this study is to investigate the various effects of individual or combined 80% ethanol extract of Anemarrhenae Rhizoma on cell viability and various anti-inflammatory factors. Methods : Anemarrhenae Rhizoma extract was prepared with 80% ethanol. MTT assay, ELISA, and Luminex were performed in LPS-activated RAW 264.7 cell line to measure cytotoxicity, Nitric oxide (NO), cyclooxygenase-2 (COX-2), prostaglandin E2 ($PGE_2$), Leukotriene B4 ($LTB_4$), and cytokines ($IL-1{\beta}$, IL-6, and $TNF-{\alpha}$), respectively. Results : At concentration of $200{\mu}g/m{\ell}$ Anemarrhenae Rhizoma extract, cytotoxicity was observed in RAW 264.7 cells. However, at concentration less than $100{\mu}g/m{\ell}$ of Anemarrhenae Rhizoma, cytotoxicity was not observed in RAW 264.7 cells. All concentration of Anemarrhenae Rhizoma extract showed no difference of NO, and $IL-1{\beta}$level in RAW 264.7 cells compared with control group. In contrast, at concentration of $100{\mu}g/m{\ell}$ Anemarrhenae Rhizoma extract significantly inhibited LPS-induced production of COX-2, PGE2, and $LTB_4$ level in RAW 264.7 cells. In addition, the production of proinflammatory cytokines (IL-6, $TNF-{\alpha}$) in LPS-induced RAW 264.7 cells was significantly decreased at concentration of all or 10, and $100{\mu}g/m{\ell}$, respectively. Conclusion : These findings demonstrate that Anemarrhenae Rhizoma has inhibitory effect on inflammatory mediators in LPS-activated RAW 264.7 cells showing possible developed as a raw material for new therapeutics to ease the symptoms related with inflammatory.
Objective : According to recent studies, Anemarrhenae Rhizoma has anti-inflammatory activities of DW extract, but it hasn't not yet conducted to evaluate inflammatory factors about 80% ethanol extract. Therefore, The aim of this study is to investigate the various effects of individual or combined 80% ethanol extract of Anemarrhenae Rhizoma on cell viability and various anti-inflammatory factors. Methods : Anemarrhenae Rhizoma extract was prepared with 80% ethanol. MTT assay, ELISA, and Luminex were performed in LPS-activated RAW 264.7 cell line to measure cytotoxicity, Nitric oxide (NO), cyclooxygenase-2 (COX-2), prostaglandin E2 ($PGE_2$), Leukotriene B4 ($LTB_4$), and cytokines ($IL-1{\beta}$, IL-6, and $TNF-{\alpha}$), respectively. Results : At concentration of $200{\mu}g/m{\ell}$ Anemarrhenae Rhizoma extract, cytotoxicity was observed in RAW 264.7 cells. However, at concentration less than $100{\mu}g/m{\ell}$ of Anemarrhenae Rhizoma, cytotoxicity was not observed in RAW 264.7 cells. All concentration of Anemarrhenae Rhizoma extract showed no difference of NO, and $IL-1{\beta}$level in RAW 264.7 cells compared with control group. In contrast, at concentration of $100{\mu}g/m{\ell}$ Anemarrhenae Rhizoma extract significantly inhibited LPS-induced production of COX-2, PGE2, and $LTB_4$ level in RAW 264.7 cells. In addition, the production of proinflammatory cytokines (IL-6, $TNF-{\alpha}$) in LPS-induced RAW 264.7 cells was significantly decreased at concentration of all or 10, and $100{\mu}g/m{\ell}$, respectively. Conclusion : These findings demonstrate that Anemarrhenae Rhizoma has inhibitory effect on inflammatory mediators in LPS-activated RAW 264.7 cells showing possible developed as a raw material for new therapeutics to ease the symptoms related with inflammatory.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 김14)의 지모 물 추출물이 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-10 등의 사이토카인 생성량 감소 결과를 통해 밝혀낸 항염증 효능에 착안하여 보다 유의적이고 효과적인 항염증 치료제로써의 가능성을 제시하기 위해 80% 에탄올로 용매를 달리하였다. 이후 항염증 효과를 보다 심도 있게 검토해 보고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.
이에 본 연구에서는 서13)와 김14)을 통해 항염증 효능이 밝혀진 知母를 80% 에탄올로 추출하고 LPS로 유발된 RAW 264.7 세포를 통해 다양한 항염증 효능 검증 및 이전 연구결과와의 비교를 실시하여 임상에서의 활용성 제고와 동시에 기초적 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
본 연구에서는 知母 80% 에탄올 추출물의 안전성과 항염증 효능을 객관적으로 검증하기 위하여, RAW 264.7 세포를 통해 세포독성 검사, NO, COX-2, PGE2, LTB4 및 사이토카인IL-1β, IL-6, TNF-α등의 생성량에 대해 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
의 지모 물 추출물이 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-10 등의 사이토카인 생성량 감소 결과를 통해 밝혀낸 항염증 효능에 착안하여 보다 유의적이고 효과적인 항염증 치료제로써의 가능성을 제시하기 위해 80% 에탄올로 용매를 달리하였다. 이후 항염증 효과를 보다 심도 있게 검토해 보고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 통해 세포독성검사를 비롯하여 다양한 염증매개인자 (proinflammatory mediators)를 확인하였다.
지모 추출물의 세포독성을 측정한 결과, 대조군에 비해 1, 10,100 (㎍/㎖) 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았으나, 200 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군에 비해 약 10% 정도 감소하는 것으로 나타나, 추후 실험 진행 시 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도를 선정하였다(Fig. 1).
실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 동결된 RAW 264.
데이터처리
)로 표시하였다. 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다 (p<0.001, p<0.01, p<0.05).
배양 후 새로운 배양액으로 교체한 후 지모 추출물 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 획득한 상청액으로 COX-2 ELISA kit으로 manufacturer's instruction에 따라 측정하였으며, 측정결과는 log-log fit을 이용하여 자동 계산된 값을 나타내었다.
배양 후 새로운 배양액으로 교체한 후 지모 추출물 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 획득한 상청액으로 PGE2 및 LTB4 ELISA kit으로 manufacturer's instruction에 따라 측정하였으며, 측정결과는 4 parameter logistic curve-fit을 이용하여 자동 계산된 값에 희석배수를 곱하여 나타내었다.
성능/효과
1. 지모 추출물은 세포 독성 검사를 통해 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 100% 이상의 생존율을 나타내어 안전한 것으로 확인되었으나, 200 ㎍/㎖ 농도에서 90%의 세포 생존율이 나타났다.
2. 지모 추출물은 NO 생성량을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타나지 않았다.
3. 지모 추출물은 COX-2, PGE2 및 LTB4 생성량을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다.
4. 지모 추출물은 cytokine IL-1β, IL-6, TNF-α생성량을 측정한 결과, IL-1β는 유의성 있는 감소가 나타나지 않았으나, IL-6는 모든 농도에서, TNF-α는 10, 100(㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다.
이 중 NO는 염증인자로서 여러 가지 만성 염증성 질환을 유발하는 주요 원인이 되며23), 염증이 발생하게 되면 대식세포가 활성화되어 NO를 생성하여 이에 의해 활성화된 백혈구와 대식세포에 의해 이물질을 제거한 후 조직재생을 통해 종료되지만 과량의 NO는 뇌경색, 퇴행성 신경질환, 당뇨 등을 유발하는 것으로 알려져 있다24,25). 본 연구결과, 지모 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 약 5% 정도 감소시키는 효능이 있었으나, 유의성이 나타나지 않았다. 이와 같은 결과는 김의 지모 물 추출물의 200 ㎍/㎖ 농도보다 우수한 결과가 도출되었으나, 큰 차이가 나타나지 않았고 비슷한 실험 결과는 지모가 NO 생성량 감소 효능은 크지 않은 것으로 확인되었다.
와 cytokine IL-6 및 TNF-α생성을 유의성 있게 감소시키는 것이 객관적으로 증명되었다. 비록 추출 공정과 용매에 차이가 있으나 지모 80% 에탄올 추출물은 물 추출물과의 비교 시 낮은 농도에서 더 우수한 효능이 있음이 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 기초적 자료를 근거로 앞서 제시한 아토피피부염, 천식, 관절염 등의 염증성 질환에 대한 전임상 단계 연구가 진행된다면 새로운 표적 치료제 후보물질에 알맞은 추출 용매 선정 및 원료로 활용될 수 있다고 판단된다.
이상의 결과들로 보아 지모 80% 에탄올 추출물은 다양한 염증성 매개 인자들에 대한 감소 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 기전과 최적의 농도 선정은 향후 보다 심도 있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이와 같은 결과는 지모 추출물이 다양한 염증성 질환의 치료제 및 기능성 소재로서 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 지모 에탄올 추출물은 안전성 평가를 통해 100 ㎍/㎖의 농도가 안전한 것으로 확인되었으며, 염증 유관 인자인 COX-2, PGE2, LTB4와 cytokine IL-6 및 TNF-α생성을 유의성 있게 감소시키는 것이 객관적으로 증명되었다. 비록 추출 공정과 용매에 차이가 있으나 지모 80% 에탄올 추출물은 물 추출물과의 비교 시 낮은 농도에서 더 우수한 효능이 있음이 나타났다.
본 연구에서 지모 추출물은 IL-1β생성량을 유의성 있게 감소시키지는 않았으나, 모든 농도에서 IL-6 생성량의 감소와 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 TNF-α의 유의성 있는 감소가 나타났다. 이와 같은 결과는 김의 지모 물 추출물에 대한 IL-1β 및 TNF-α생성량 결과와 일치하며, TNF-α생성량은 물 추출물의 200 ㎍/㎖ 보다 더 효과적인 감소가 나타났으며, IL-6 생성량 감소에 효능이 있음이 본 연구를 통해 확인되었다. 이와 같은 결과는 지모 추출물이 염증성 사이토카인의 효과적인 감소를 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방과 치료에 활용될 수 있으며, 특히 관절염 질환에 대한 임상 소견 시 높게 생성되는 IL-6의 우수한 감소능과 앞서 확인된 COX-2 억제의 유의적인 결과는 관절염 치료제로써의 가능성을 제시하고 있다.
지모 추출물의 COX-2 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 100 ㎍/㎖ 농도에서 약 18%의 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타나, COX-2에 대한 효능이 확인되었다(Fig. 3).
지모 추출물의 LTB4 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 100 ㎍/㎖ 농도에서 약 19%의 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타나, LTB4에 대한 효능이 확인되었다(Fig. 5).
지모 추출물의 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 100㎍/㎖ 농도에서 약 5%의 NO 생성을 감소시키는 것으로 확인되었으나, 유의성이 나타나지는 않았다(Fig. 2).
지모 추출물의 PGE2 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 100 ㎍/㎖ 농도에서 약 18%의 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타나, PGE2에 대한 효능이 확인되었다(Fig. 4).
후속연구
따라서 본 연구 결과를 기초적 자료를 근거로 앞서 제시한 아토피피부염, 천식, 관절염 등의 염증성 질환에 대한 전임상 단계 연구가 진행된다면 새로운 표적 치료제 후보물질에 알맞은 추출 용매 선정 및 원료로 활용될 수 있다고 판단된다. 다만, 지모의 물 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 NO, IL-1β등의 염증 매개 인자에 대한 생성을 유의적으로 감소시키지 못한 점은 추후 심도 있는 연구를 통해 밝혀져야 할 것으로 사료된다.
비록 추출 공정과 용매에 차이가 있으나 지모 80% 에탄올 추출물은 물 추출물과의 비교 시 낮은 농도에서 더 우수한 효능이 있음이 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 기초적 자료를 근거로 앞서 제시한 아토피피부염, 천식, 관절염 등의 염증성 질환에 대한 전임상 단계 연구가 진행된다면 새로운 표적 치료제 후보물질에 알맞은 추출 용매 선정 및 원료로 활용될 수 있다고 판단된다. 다만, 지모의 물 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 NO, IL-1β등의 염증 매개 인자에 대한 생성을 유의적으로 감소시키지 못한 점은 추후 심도 있는 연구를 통해 밝혀져야 할 것으로 사료된다.
이상의 결과들로 보아 지모 80% 에탄올 추출물은 다양한 염증성 매개 인자들에 대한 감소 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 기전과 최적의 농도 선정은 향후 보다 심도 있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이와 같은 결과는 지모 추출물이 다양한 염증성 질환의 치료제 및 기능성 소재로서 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
이와 같은 결과는 김의 지모 물 추출물에 대한 IL-1β 및 TNF-α생성량 결과와 일치하며, TNF-α생성량은 물 추출물의 200 ㎍/㎖ 보다 더 효과적인 감소가 나타났으며, IL-6 생성량 감소에 효능이 있음이 본 연구를 통해 확인되었다. 이와 같은 결과는 지모 추출물이 염증성 사이토카인의 효과적인 감소를 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방과 치료에 활용될 수 있으며, 특히 관절염 질환에 대한 임상 소견 시 높게 생성되는 IL-6의 우수한 감소능과 앞서 확인된 COX-2 억제의 유의적인 결과는 관절염 치료제로써의 가능성을 제시하고 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응은 무엇인가?
염증반응은 생체에 해로운 자극에 대한 방어반응으로 생체의 세포와 조직이 외부에서 자극을 받을 때 그 영향을 국소화하여 손상된 부위를 정상으로 회복하고 유지하려는 생체의 방어기전이다1). 그러나 이러한 방어기전이 인체에서 원활하게 이루어지지 않아 염증반응이 지속될 경우, 피부질환, 천식, 암, 관상동맥질환, 류마티스관절염 등과 같은 다양한 염증성 질환을 일으키는 주된 요인이 된다2).
Tumor necrosis factor 와 같은 염증성 사이토카인은 어떠한 기능저해와 염증질환을 일으키는가?
또한, Tumor necrosis factor(TNF)-α는 중요한 염증성 사이토카인으로서, 염증반응을 IL-1β와 마찬가지로 야기 시키지만, 미세혈관의 혈전, 모세혈관의 누출 등 전신반응으로 조직 손상을 초래하게 된다28). 이와 같은 염증성 사이토카인은 면역계 항상성의 불균형을 초래하여 다양한 세포와 조직에 기능저해를 일으키고 제 2형 당뇨, 류마티스관절염, 과민반응, 혈관염 등과 같은 염증질환의 원인이 된다. 본 연구에서 지모 추출물은 IL-1β생성량을 유의성 있게 감소시키지는 않았으나, 모든 농도에서 IL-6 생성량의 감소와 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 TNF-α의 유의성 있는 감소가 나타났다.
방어기전이 인체에서 원활하게 이루어지지 않아 염증반응이 지속될 경우 어떠한 질환이 발생되는가?
염증반응은 생체에 해로운 자극에 대한 방어반응으로 생체의 세포와 조직이 외부에서 자극을 받을 때 그 영향을 국소화하여 손상된 부위를 정상으로 회복하고 유지하려는 생체의 방어기전이다1). 그러나 이러한 방어기전이 인체에서 원활하게 이루어지지 않아 염증반응이 지속될 경우, 피부질환, 천식, 암, 관상동맥질환, 류마티스관절염 등과 같은 다양한 염증성 질환을 일으키는 주된 요인이 된다2). 따라서 빠르고 효과적인 염증 물질에 대한 방어와 제거능은 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료의 핵심이라 할 수 있다.
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