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문제 정의
- 5-7) 또한 후성유전적 변화는 인종이나 환경과 같은 요인에 영향을 받기 때문에 우리나라 환자들을 대상으로 전유전체 수준의 메틸화 profile에 대한 확인을 통해 기존에 발견되지 않았던 바이오마커를 발굴하는 것이 필요하기에 본 연구를 통하여 한국인 두경부암에 특이적인 신규 메틸화 바이오마커를 발굴하고자 하였다.8,9)
- 또한 최근의 연구동향이 후성유전적 변화로 확장되는 추세임을 차치하여도, 두경부암의 경우 흡연, 음주, 바이러스 등 환경적인 요인이 발암과정에 깊이 관여하는 것으로 받아들여 지고 있기 때문에, 6,20) 후성유전적인 유전체의 변화가 발암과정에 중요한 것은 자명하다. 따라서 본 연 구에서는 기존에 후성유전적으로 연구가 활발히 진행되지 않은 두경부암에서 전유전체적인 분석을 통해서 기존에 알려지지 않은 메틸화 바이오마커를 찾고자 하였다.21)
- 임상적인 유용성 뿐만 아니라, 본 연구에서는 HOXB5와 HMX2가 두경부암에서 발암과정에 관련되는 분자적 기전을 세포수준에서도 확인하고자 하였다. HOXB5와 HMX2가 과발현되어 있는 두경부암세포에서 RNA interference를 이용하여 발현을 억제하였을 때 proliferation, migration 및 invasion 이 증가하는 것으로 미루어 보아, 위의 두 유전자가, 암 억제유전자일 가능성을 확인하였으며, 분자적 수준에서는 HOXB5와 HMX2가 EMT를 억제하는 것을 확인하였다.
제안 방법
- 10) 절차를 간단히 기술하면 다음과 같다. 10명의 두경부암 환자에서 genomic DNA를 종양과 주변의 종양이 아닌 조직에서 추출한 뒤, 음파를 이용하여 DNA를 단편화 시켰다. 단편화된 genomic DNA 0.
- 2005년에서 2012년까지 충남대학교 병원 이비인후과에 내원하여 두경부암으로 진단받고 수술하여 인체자원은행에 paired 된 비암성조직 (non-tumor tissue)와 함께 조직이 확보되어 있는 환자 135명의 의무기록을 후향적으로 분석하였으며, 동일한 환자로 확보된 Tissue microarray를 면역조직화학염색을 통하여 발굴된 메틸화 바이오마커의 발현양상을 분석하였다.
- After removed lower singnal probe from unsupervised hierarchical clustering based on Pearson’s correlation, group A reliable probes were selected using principal component analysis.
- 종양이 아닌 조직에서 역시 DNA를 추출하여 Cy3으로 labelling 한다. DNA를 PCR purification kit (Qiagen)을 이용하여 정제한 이후, 총 27,800개의 알려진 CpG island를 표지할 수 있는 237,000개의 oligonucleotide의 probe와 혼성화 반응시켜 메틸화 DNA를 확인한다. 이때 quality control을 위하여 이미 알고 있는 사람세포주의 특정 메틸화 유전자를 MeDIA 후 gene-specific PCR 방법으로 확인하였다.
- MeDIA를 이용한 전유전체의 메틸화 분석을 통해 얻은 후보유전자를 두경부암 세포주와 조직을 이용하여 검증하였다. 세포주를 이용한 검증에서 대조군으로 human fibroblast (hFB), 두경부암 세포주로는 FaDu, SNU1041, SNU1076, SCC15, SCC25, YD8을 이용하였다.
- 두경부암 세포주인 SCC15, YD8 세포주를 이용하여 메틸화 바이오마커의 발현조절에 따른 단일세포수준의 cell proliferation 을 WST-1 cell proliferation assay(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) 를 이용하여 실험하였으며, migration 및 invasion 의 변화를 Transwell chambers (24-well, Costar, Cambridge, MA, USA)와 Matrigel (Coring, MA, USA)을 이용하여 확인하였다.12)
- 세포주를 이용한 검증에서 대조군으로 human fibroblast (hFB), 두경부암 세포주로는 FaDu, SNU1041, SNU1076, SCC15, SCC25, YD8을 이용하였다. 두경부암 조직은 2015~2016년 충남대학교 병원 이비인후과에 내원하여 두경부암으로 진단받은 환자 20명과 양성종양(non-tumor)로 수술받은 환자 12명의 조직을 이용하여 DNA 염기서열의 정성적, 정량적 분석을 간편하고 정확 하게 수행할 수 있는 next-generation sequencing 기반의 잘 알려진 실험기법인 pyrosequencing 을 이용하여 분석하였다.11)
- 두경부암에서 HOXB5와 HMX2의 암 억제유전자로서의 기능을 확인하기 위해 두 유전자의 발현이 내인적으로 올라가 있는 두경부암 세포주인 SCC15와 YD8에서 이를 siRNA를 이용하여 발현을 억제하였을 때의 기능상 변화를 확인하는 실험을 진행하였다.
- 또한 Western blotting을 이용하여 발암 및 전이과정에 중요한 상피-간질세포 이행 (Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)과 관련된 표지자: anti-vimentin, anti-Slug, anti-β-actin (1:1,000; Cell Signaling Technology Inc.), anti-E-cadherin (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 확인하였다.
- 세포수준에서 메틸화 바이오마커의 가능성을 확인한 HOXB5와 HMX2의 메틸화 정도를 조직 수준에서 정량적으로 분석하기 위해 bisulfite pyrosequencing을 시행하여 methylation index(%)를 종양과 비종양에서 비교하였다 (Fig. 3A). Fig.
대상 데이터
- ), anti-E-cadherin (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 확인하였다. HOXB5와 HMX2의 확인을 위한 항체로는 anti-HOXB5 (1:1000; abcam; ab26079), anti-HMX2 (1:1000; GeneTex; GTX81571)를 사용하였다.
- MeDIA를 이용한 전유전체의 메틸화 분석을 통해 얻은 후보유전자를 두경부암 세포주와 조직을 이용하여 검증하였다. 세포주를 이용한 검증에서 대조군으로 human fibroblast (hFB), 두경부암 세포주로는 FaDu, SNU1041, SNU1076, SCC15, SCC25, YD8을 이용하였다. 두경부암 조직은 2015~2016년 충남대학교 병원 이비인후과에 내원하여 두경부암으로 진단받은 환자 20명과 양성종양(non-tumor)로 수술받은 환자 12명의 조직을 이용하여 DNA 염기서열의 정성적, 정량적 분석을 간편하고 정확 하게 수행할 수 있는 next-generation sequencing 기반의 잘 알려진 실험기법인 pyrosequencing 을 이용하여 분석하였다.
- 앞에서 확인한 두경부암 메틸화 바이오마커인 HOXB5와 HMX2의 임상적 유용성을 확인하기 위하여, 후향적 의무기록 분석을 통한 임상정보가 연결된 135명의 환자의 조직에서 HOXB5와 HMX2±의 발현을 확인하였다.
데이터처리
- 또한, 두 메틸화 바이오마커의 발현에 따른 전체생존률 (Overall survival, OS)과 무병생존률 (Disease free survival, DFS)을 Kaplan-Meier curve를 이용하여 분석하였다. 두 메틸화 바이오마커 모두에서 발현이 높을수록 전체생존률과 무병생존률이 높았으며, 발현이 낮을수록 전체생존률과 무병생존률이 낮은 경향성을 확인할 수 있었으나, HOXB5의 경우 통계적으로도 유의하였던 반면 (OS, 50.
이론/모형
- CpG microarray analysis 는 전체유전자를 대상으로 메틸화된 DNA를 탐색하여 이를 특이적으로 선택 분리할 수 있는 MethylCaptureTM 방식을 이용하였다.10) 절차를 간단히 기술하면 다음과 같다.
- Stepwise filtering processes for candidate gene selection. The methylated DNA was separately enriched from 10 primary head and neck tumors and paired, adjacent nontumor tissues by a MeDIA technique. The methylated DNAs (Cy5) were individually compared with amplified common reference DNA (Cy3) without methylation enrichment.
- DNA를 PCR purification kit (Qiagen)을 이용하여 정제한 이후, 총 27,800개의 알려진 CpG island를 표지할 수 있는 237,000개의 oligonucleotide의 probe와 혼성화 반응시켜 메틸화 DNA를 확인한다. 이때 quality control을 위하여 이미 알고 있는 사람세포주의 특정 메틸화 유전자를 MeDIA 후 gene-specific PCR 방법으로 확인하였다.10)
성능/효과
- 1,2) 종양유전자의 활성화에는 유전자 증폭(gene amplification), 점돌연변이(point mutation), 염색체 전좌(chromatin translocation)등이 관여하며, 종양억제 유전자의 불활성화에는 유전자 변이, 유전자 상실(gene deletion), 그리고 프로모터CpG island의 과메틸화가 관여한다. 여기서 유전자 증폭, 점돌연변이, 염색체 전좌, 유전자상실 등은 DNA 염기서열의 변동을 수반하는 유전적 변화(genetic change)인 반면, CpG island과메틸화는DNA염기서열의 변동없이 유전자의활성을 억제할 수 있다는 점에서 유전적 변화와 구별하여 후성유전적 변화(epigenetic change)라고 부른다.
- 여기서 유전자 증폭, 점돌연변이, 염색체 전좌, 유전자상실 등은 DNA 염기서열의 변동을 수반하는 유전적 변화(genetic change)인 반면, CpG island과메틸화는DNA염기서열의 변동없이 유전자의활성을 억제할 수 있다는 점에서 유전적 변화와 구별하여 후성유전적 변화(epigenetic change)라고 부른다.2) 후성유전적 변화에는 CpG island 과메틸화 외에도 히스톤 변경, 크로마틴 구조의 변경, microRNA 등이 포함된다.1)
- 20) 뿐만 아니라, 일반적으로 후성유전적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마커로도 암을 초기에 비침습적으로 진단 할 수 있다.20) 더욱이, 기존에 많이 사용되고 있는 단백질 마커나 RNA 보다 훨씬 안정적으로 존재하며, 서로 다른 환자에서 한 유전자 내에서의 여러 위치를 분석해야 하는 다른 DNA 변이와는 달리 메틸화는 한 유전자의 같은 위치에서 일어나므로 분석방법 상의 장점도 있어 매우 유망하고 효율적인 진단도구로 사용할 수 있다.20,24)
- 22) HMX2 는 10번 염색체에 존재하며, 역시 발생과정에서 기관형성을 조절하는 전사인자를 만들어내는 유전자로, 세포분열 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 특히 내이기형 (inner ear malformation), 전정기능부전 (vestibular dysfunction), 청력소실 (hearing loss)과 관계된다고 연구되어 있으나 암과의 관련성은 많이 알려져 있지 않다.23) 본 연구에서 전유전체 수준의 MeDIA CpG microarray와 임상조직 대상 bisulfite pyrosequencing 을 통하여 두경부암에서 과메틸화되어 있으며, 암 억제유전자로서의 가능성을 최초로 확인하였고 나아가 진행된 병기와 관련되어 있으며, 유의한 예후인자가 될 수 있다는 것을 확인하였다는 점에서 의미가 있다.
- 1). 그 중에서 1) positive call in multiple probe, 2) promoter 혹은 regulatory regions, 3) novelty의 기준으로 선별하여 과메틸화 표적 334개 중, 총 7개의 기존에 연구되지 않은 메틸화 바이오마커 후보 유전자 (SLC30A3, LHX8, GATA4, HOXB5, ZNF274, HMX2, HOXA7)를 확인하였다.
- 2) DNA 메틸화는 정상적인 개체의 발생에서도 genomic imprinting, X-chromosome inactivation 등 다양한 생명현상에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 다양한 암종의 발생에서 중요한 역할을 한다는 연구결과가 축적되고 있다.3) 암 조직에서는 정상 세포와는 다른 두 종류의 DNA 메틸화 현상이 나타나는데, 유전체 전반에 걸친 저메틸화 (hypomethylation) 현상과 유전자 발현 조절부위 (promoter)에 위치한 CpG island (CpG 디뉴클레오티드의 밀도가 높은 시퀀스)의 과메틸화 (hypermethylation) 현상이 그것이다. 저메틸화 현상은 주로 유전자와 유전자 사이 지역(intergenic region)에서 나타나며, 이는 염색체를 불안정하게 만들어 세포분열 과정에서 염색체의 재조합(recombination), 전이(translocation), 절단(deletion), 재배열(rearrangement) 등을 일으키는 것으로 생각되며, 암 억제유전자(tumor suppressor), 세포주기조절(cell cycle) 유전자, DNA 수리(repair) 관련 유전자, 세포 접착(adhesion) 관련 유전자가 조절부위의 CpG island의 과메틸화에 의해 발현이 억제되면, 세포는 비정상적으로 증식하며, 유전적 안정성을 유지하지 못하게 되어 추가적인 돌연변이를 유발하여 암이 유발된다고 알려져 있다.
- 3A). Fig. 3B의 결과에서 확인할 수 있듯이, HOXB5와 HMX2 모두 paired 된 비종양 부위에 비해서 종양 부위에서 methylation index가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있다 (HOXB5의 경우 95%의 시료, HMX2의 경우 85%의 시료). 뿐만 아니라, 12명의 양성종양 환자의 조직과 비교하였을 때도, 종양조직에서 methylation index의 평균이 유의하게 높은 것을 확인하여, HOXB5와 HMX2의 메틸화 바이오마커의 가능성을 다양한 조직 수준에서 확인하였다.
- 임상적인 유용성 뿐만 아니라, 본 연구에서는 HOXB5와 HMX2가 두경부암에서 발암과정에 관련되는 분자적 기전을 세포수준에서도 확인하고자 하였다. HOXB5와 HMX2가 과발현되어 있는 두경부암세포에서 RNA interference를 이용하여 발현을 억제하였을 때 proliferation, migration 및 invasion 이 증가하는 것으로 미루어 보아, 위의 두 유전자가, 암 억제유전자일 가능성을 확인하였으며, 분자적 수준에서는 HOXB5와 HMX2가 EMT를 억제하는 것을 확인하였다. 이는 기존에 세포 내에서 HOXB5와 HMX2가 발생과정에서 기관형성에 관여한다고 알려진 것과도 연관될 수 있는 결과이다.
- MeDIA microarray와 통계적방법을 이용하여 발굴한 7개의 바이오마커 후보 유전자의 두경부암 세포주에서의 발현을 확인하기 위하여 두경부암 점막의 정상세포를 대변하는 섬유세포 (hFB)와 두경부암 세포주 (FaDu, SNU1041, SNU1076, SCC15)에서 각 후보유전자의 mRNA발현을 살펴본 결과, ZNF274와 HOXA7은 실험한 모든 두경부암 세포주에서 정상세포와 유사하게 발현되고 있어 메틸화 마커의 유용성이 적은 것으로 확인되었으며, SLC30A3, LHX8, GATA4는 정상세포주에서 발현이 거의 되지 않고 있어 역시, 메틸화 마커의 유용성을 확인하기 어려워, 최종적으로 Homeobox B5 (HOXB5)와 H6 Family Homeobox 2 (HMX2)가 메틸화 마커로서 가능성이 있음을 확인하였다 (Fig. 2A).
- 단변량분석을 시행하였을 때, HOXB5와 HMX2 모두에 서 나이, 성별, 림프절 전이, 조직학적인 분화도에 따른 유의한 발현차이는 없었으나, T stage 와 AJCC stage에서는 HOXB5와 HMX2 모두 stage III+IV에서 통계적으로 유의하게 낮은 발현을 보였다 (Table 1). T stage와 AJCC stage 를 이용하여 다변량 분석 (Binary logistic regression analysis)을 시행하였을 때, 진행된 T stage (Advanced T stage)에서 통계적으로 유의하게 HOXB5 (Table 2)와 HMX2 (Table 3) 모두 낮은 발현을 확인하였다.
- 다음으로 Transwell chamber를 이용하여 migration assay를 시행하였으며, Matrigel을 추가하여 invasion assay를 시행하였을 때, 역시 두 세포주 모두에서 HOXB5와 HMX2를 억제하였을 때, migration과 invasion 모두 증가하여, 일관성 있게 두 유전자가 암 억제유전자임을 증명하였다 (Fig. 6).
- 4개월 (2-180개월) 이었다. 단변량분석을 시행하였을 때, HOXB5와 HMX2 모두에 서 나이, 성별, 림프절 전이, 조직학적인 분화도에 따른 유의한 발현차이는 없었으나, T stage 와 AJCC stage에서는 HOXB5와 HMX2 모두 stage III+IV에서 통계적으로 유의하게 낮은 발현을 보였다 (Table 1). T stage와 AJCC stage 를 이용하여 다변량 분석 (Binary logistic regression analysis)을 시행하였을 때, 진행된 T stage (Advanced T stage)에서 통계적으로 유의하게 HOXB5 (Table 2)와 HMX2 (Table 3) 모두 낮은 발현을 확인하였다.
- 또한, 두 메틸화 바이오마커의 발현에 따른 전체생존률 (Overall survival, OS)과 무병생존률 (Disease free survival, DFS)을 Kaplan-Meier curve를 이용하여 분석하였다. 두 메틸화 바이오마커 모두에서 발현이 높을수록 전체생존률과 무병생존률이 높았으며, 발현이 낮을수록 전체생존률과 무병생존률이 낮은 경향성을 확인할 수 있었으나, HOXB5의 경우 통계적으로도 유의하였던 반면 (OS, 50.7% vs. 76.1%, p = 0.001; DFS, 52.1% vs. 74%, p = 0.001), HMX2의 경우 그 차이가 경미하여 통계적인 유의성이 확인되지는 않았다.
- 두경부암에서 비정상적으로 메틸화된 유전자의 CpG island를 포괄적으로 확인하기 위해 10명의 두경부암 환자에서 암조직과 주위의 비암조직에서 채취된 genomic DNA의 MeDIA CpG microarray 방식을 이용하여 비교한 결과, 정상과 비교하여 암조직에서 특이적으로 메틸화 양상에 차이가 있는 reliable 한 메틸화 표적이 841개(저메틸화 표적 507개, 과메틸화 표적 334개) 확인되었다 (Fig. 1). 그 중에서 1) positive call in multiple probe, 2) promoter 혹은 regulatory regions, 3) novelty의 기준으로 선별하여 과메틸화 표적 334개 중, 총 7개의 기존에 연구되지 않은 메틸화 바이오마커 후보 유전자 (SLC30A3, LHX8, GATA4, HOXB5, ZNF274, HMX2, HOXA7)를 확인하였다.
- 먼저 WST-1 assay를 이용하여 cell proliferation 을 확인하였을 때, 두 세포주 모두에서 HOXB5와 HMX2를 억제하였을 때, proliferation 이 통계적으로 유의하게 증가하는 것이 확인되어, 암 억제유전자 (Tumor suppressor gene)의 가능성이 확인되었다 (Fig. 5).
- 발굴한 후보 바이오마커의 메틸화 의존성을 확인하기 위하여 DNA methyltransferase의 억제제인 5-Aza-2'-deoxycytidine (decitabine; DAC)를 이용하여 두경부암 세포주 (SCC25, YD8)에서 HOXB5와 HMX2를 탈메틸화 시켰을 때, HOXB5의 경우 SCC25에서 발현이 증가하였으며, HMX2의 경우 두 세포주 모두에서 발현이 증가하는 것을 확인하여 HOXB5와 HMX2의 메틸화 의존성을 확인하였다 (Fig. 2B).
- 분자적 수준에서 암세포의 proliferation, migration 및 invasion과 관련 되어있는 EMT hall-marker을 Western blotting을 통하여 단백질 수준에서 분석하였을 때, 두 세포주 모두에서 HOXB5와 HMX2를 억제하였을 때, E-cadherin 발현이 증가하고, Vimentin과 Slug의 발현은 감소하는 것을 확인하였는데, 이는 위에 시행한 phenotype 실험과 일관되는 결과였다 (Fig. 7).
- 3B의 결과에서 확인할 수 있듯이, HOXB5와 HMX2 모두 paired 된 비종양 부위에 비해서 종양 부위에서 methylation index가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있다 (HOXB5의 경우 95%의 시료, HMX2의 경우 85%의 시료). 뿐만 아니라, 12명의 양성종양 환자의 조직과 비교하였을 때도, 종양조직에서 methylation index의 평균이 유의하게 높은 것을 확인하여, HOXB5와 HMX2의 메틸화 바이오마커의 가능성을 다양한 조직 수준에서 확인하였다.
후속연구
- 본 연구결과는 향후 대단위의 public한 유전체 database를 이용하여 검증이 필요하며, 위 유전자의 메틸화를 유발하는 인자, 메틸화로 인한 발암에 관계된 분자적 메커니즘의 변화, 자손에 대한 유전적 영향 등에 대한 보다 많은 연구가 필요할 것을 생각한다. 그러나, 먹고, 마시고, 숨쉬는 기능과 같이 생명유지에 필수적인 기능과 직결되어 그 기능의 보존을 위해 두경부암의 조기진단 및 치료가 절실하지만 아직 확립된 조기진단 바이오마커가 없는 현실과, 두경부암의 발암과정에 환경적인 요인이 중요하다는 점을 고려할 때, 두경부암 특이 후성유전적 메틸화 바이오마커를 발굴하는 연구는 두경부암의 조기진단 뿐만 아니라, 기존의 항암치료에 대한 저항을 극복할 수 있는 새로운 병합항암치료법의 개발에도 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다.20)
- 본 연구결과는 향후 대단위의 public한 유전체 database를 이용하여 검증이 필요하며, 위 유전자의 메틸화를 유발하는 인자, 메틸화로 인한 발암에 관계된 분자적 메커니즘의 변화, 자손에 대한 유전적 영향 등에 대한 보다 많은 연구가 필요할 것을 생각한다. 그러나, 먹고, 마시고, 숨쉬는 기능과 같이 생명유지에 필수적인 기능과 직결되어 그 기능의 보존을 위해 두경부암의 조기진단 및 치료가 절실하지만 아직 확립된 조기진단 바이오마커가 없는 현실과, 두경부암의 발암과정에 환경적인 요인이 중요하다는 점을 고려할 때, 두경부암 특이 후성유전적 메틸화 바이오마커를 발굴하는 연구는 두경부암의 조기진단 뿐만 아니라, 기존의 항암치료에 대한 저항을 극복할 수 있는 새로운 병합항암치료법의 개발에도 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다.
- 본 연구결과를 통해 HOXB5와 HMX2가 두경부암 특이 메틸화 바이오마커로 이용될 수 있으며, 후성유전적 바이오마커가 유전적 바이오마커와 비교하여 가지는 장점으로 인하여, 조기진단, 예후판정에 임상적으로 적용할 수 있는 가능성이 더 크다고 할 수 있다. 예컨대, DNA의 메틸화는 질환의 초기에 일어나는 것으로 알려져 있고, 높은 민감도와 특이도를 가지며 최소의 증상에서도 보여 질 수 있을 만큼 충분한 양으로 존재하기 때문에 암의 조기진단에 유전적 마커에 비하여 유리하다.
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