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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 쓴메밀 종자의 추출방법에 따른 추출물의 루틴과 퀘세틴 함량을 분석하여 정밀성, 재현성, 정확도 및 안정성을 비교 검토하였다. 이를 통해 분석의 안정성이 검정된 효율적인 추출방법을 제시하여 식물체내 성분 함량 및 루틴 고함유 계통 선발 등에 기반기술로 활용하고자 하였다
- 본 연구는 초고성능 액체크로마토그래피(Ultra Performance LiquidChromatography, UPLC)를 이용하여 쓴메밀 종자에서 루틴 및 퀘세틴 함량을 신속 정확히 평가하기 위한 효율적인 추출방법을 구명하고자 수행하였다. 추출방법으로 환류냉각추출, 초음파추출, 상온교반추출, 초음파후 환류냉각추출, 상온교반 후 환류냉각추출, 상온교반후 초음파추출, 상온교반과 초음파 후 환류냉각추출등 7가지 방법을 비교하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 쓴메밀 종자의 추출방법에 따른 추출물의 루틴과 퀘세틴 함량을 분석하여 정밀성, 재현성, 정확도 및 안정성을 비교 검토하였다. 이를 통해 분석의 안정성이 검정된 효율적인 추출방법을 제시하여 식물체내 성분 함량 및 루틴 고함유 계통 선발 등에 기반기술로 활용하고자 하였다
가설 설정
- 3)Limits of detection (LOD) was estimated based on the lowest concentration giving signal intensity equal to or greater than the sum of the blank signal plus three times.
- 4)Limits of quantitation (LOQ) was estimated based on the lowest quantitation giving signal intensity equal to or greater than the sum of the blank signal plus three times.
제안 방법
- 1)Intra-day repeatability was evaluated using five independent analyses of replicate samples for one day.
- 1)Precision was determined in tartary buckwheat seeds on the same day (intra-day repeatability) and daily for 9 times over a period of 5 days (interday precision). The results were expressed as mean and relative standard deviation (RSD).
- 2)Inter-day precision was evaluated using three independent analyses of replicate samples performed for three days.
- UPLC 분석방법을 위해 검출할 수 있는 최소량을 알기 위한검출한계(limits of detection, LOD)와 UPLC방법으로 루틴과 퀘세틴의 정량 분석이 가능한 최소한의 농도를 알기 위한 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 구하였다. 표준물질의 LOD와LOQ는 계산식은 표준편차(SD) 값에 각각 3.
- 본 연구에서는 가장 널리 사용되고 있는 상온교반추출(13,15,23,24)의 단점을 개선하기 위해 환류냉각추출방법의 추출시간을 1시간으로 단축하고, 추출효율을 높이기 위해추출온도를 80℃로 높게 재설정하였다. 또한 UPLC 방법을 사용함으로써 분석시간을 HPLC 분석의 37-61분(11,17)에서 23분으로 대폭 단축하였다. 그 결과, 소량의 퀘세틴도 효과적으로 검출할 수 있는 수준으로 추출효율이 크게 향상되었으며 분석시간도 대폭 단축되었다
- 이러한 결과는 본 연구에서 제시한 분석방법이 루틴과 퀘세틴 분석에 있어 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 연구에서는 다양한 추출방법을 대상으로 정밀성을 분석하고, 유효성 검정을 실시하여 쓴메밀의 루틴과 퀘세틴 함량을 분석하는데 적합한 추출방법인 환류냉각추출방법을 선발하였다.
- 루틴과 퀘세틴 함량 분석의 정밀성을 확인하기 위하여 루틴과퀘세틴의 표준물질 농도별(0.10, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80 mg/mL)로제조하여 하루 동안 5반복으로 분석하여 일내 반복성(intra-dayrepeatability)을 구하였고, 농도별로 조성된 동일한 추출물을 3일동안 연속적으로 분석하여 RSD를 계산하여 일간 정밀성(inter-dayprecision)을 비교하였다(Table 4). 루틴의 일내 반복성은 1.
- 51분이었다. 루틴과 퀘세틴 함량(mg/100 g, 자연건조한 종실 기준, 수분함량 11.6%)을 표준물질의 UPLC 피크 면적을 이용하여 계산하였다.
- , Bucheon, Korea)를 이용하여 280 rpm으로 교반하면서 24시간 추출하였다. 복합처리는상온교반, 초음파추출, 환류냉각추출 순서대로 2가지 또는 3가지 연속으로 처리하였다.
- 관측에 사용된 검출파장(detection wavelength)은 259 nm이고, 시료주입량은 1 μL로 하였다. 본 분석에 사용된 표준물질 루틴과 퀘르세튼의 피크와 추출물 샘플의 각 피크는 표준물질의 머무름 시간(retention time, RT)과 비교하여 크로마토그램으로 나타내었다(Fig 1.). 표준물질의 루틴과 퀘세틴 RT는 각각 9.
- 본 연구에서는 ICH Q2B 유효성 검증방법에 따라 선형성(linearity), 정밀성(precision), 정확도(accuracy)를 확인하였다(21,22).루틴과 퀘세틴 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질농도별(0.
- 환류냉각추출과 초음파추출은 추출을 위한 별도의 기기를 구입해야 한다는 단점이 있지만, 일단 구입한 후에 단시간(1시간)에 많은 양을 추출할수 있다는 장점이 있다. 본 연구에서는 가장 널리 사용되고 있는 상온교반추출(13,15,23,24)의 단점을 개선하기 위해 환류냉각추출방법의 추출시간을 1시간으로 단축하고, 추출효율을 높이기 위해추출온도를 80℃로 높게 재설정하였다. 또한 UPLC 방법을 사용함으로써 분석시간을 HPLC 분석의 37-61분(11,17)에서 23분으로 대폭 단축하였다.
- 본 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위해서 환류냉각추출, 초음파추출, 상온교반추출을 단독 또는 혼용하여 쓴메밀 종자에서 7가지 방법으로 추출한 루틴과 퀘세틴 함량을 비교·분석하였다.
- 쓴메밀 종자의 7가지 추출방법에 따라 처리된 시험용액을 UPLC를 이용하여 일내 반복성과 일간 정밀성을 분석하였다(Table 2). 즉, 하루동안 7가지 추출방법을 9반복으로 수행하여 총 4회 분석하여 일내 반복성을 구하였고, 1일 1구간으로 하여 같은 샘플을5일동안 연속적으로 UPLC를 이용하여 일간정밀성을 분석하였다.
- 쓴메밀 환류냉각추출에 대한 루틴과 퀘세틴 분석의 정확도를 평가하기 위해 표준물질을 저농도(0.1), 중간농도(0.4), 고농도(1.0mg/mL)로 준비한 후 환류냉각추출한 샘플을 혼합하여 3반복으로 분석하였으며, 이론적 농도과 실제 측정농도를 구하여 회수율을계산하였다(Table 5). 루틴과 퀘세틴의 회수율은 각각 98.
- 쓴메밀의 루틴 및 퀘세틴 추출법을 향상시키기 위하여 개선된 환류냉각 추출법의 유효성 검증을 위하여 선형성, 정밀성, 정확도를 확인하였다. 루틴과 퀘세틴의 선형성을 결정하기 위해 표준용액을 농도별로 분석하여 y=4,134,067x+12.
- 효율적인 쓴메밀 추출방법을 찾고자 논문으로 보고된 메밀 추출방법을 참고하여(13,14,18,19) 7가지 추출방법을 1차 실험에서 9반복으로 하여 4차 실험까지 총 36반복으로 수행하였다. 쓴메밀종자 분쇄시료 1g에 100% 메탄올을 가한 후 환류냉각추출(refluxextraction, RE), 초음파추출(ultrasonification, UE), 상온교반추출(stirrer extraction, SE), 초음파 후 환류냉각추출(reflux extractionafter ultrasonification, URE), 상온교반 후 환류냉각추출(refluxextraction after stirrer extraction, SRE), 상온교반후 초음파추출(ultrasonification after stirrer extraction, SUE), 상온교반과 초음파후 환류냉각추출(reflux extraction with ultrasonification after stirrer extraction, SURE)로 단독 또는 혼용으로 추출하는 방법으로수행하였다(Table 1).
- 25 mL/min으로 일정하게 흘려주었다. 용매 이송은 기울기(gradient) 방식으로, 용매 B를 7%로 시작하여 2분에서11분까지 7%에서 17%로 증가시켰다. 이후 11분에서 13분까지 용매 B를 17%에서 25%로 증가시킨 후 19분까지 그 농도를 유지시켰다.
- 쓴메밀 종자의 7가지 추출방법에 따라 처리된 시험용액을 UPLC를 이용하여 일내 반복성과 일간 정밀성을 분석하였다(Table 2). 즉, 하루동안 7가지 추출방법을 9반복으로 수행하여 총 4회 분석하여 일내 반복성을 구하였고, 1일 1구간으로 하여 같은 샘플을5일동안 연속적으로 UPLC를 이용하여 일간정밀성을 분석하였다. 분석을 통해 얻어진 면적은 보정선에 의해 정량한 농도별 검출농도의 표준편차를 검출농도 평균으로 나눈 비율의 백분율(RSD,%)로 나타내었다.
- 초음파추출은 물을 채운 40 kHz (±6%)의 초음파 수조(Bransonic US/2415-U, Branson Ultrasonics Corporation, Banbury, MO, USA)에서 시료와 용매를 넣은 유리병이 바닥에 닿지 않도록 하여 50℃ 1시간 초음파 처리하여 추출하였다.
- 본 연구는 초고성능 액체크로마토그래피(Ultra Performance LiquidChromatography, UPLC)를 이용하여 쓴메밀 종자에서 루틴 및 퀘세틴 함량을 신속 정확히 평가하기 위한 효율적인 추출방법을 구명하고자 수행하였다. 추출방법으로 환류냉각추출, 초음파추출, 상온교반추출, 초음파후 환류냉각추출, 상온교반 후 환류냉각추출, 상온교반후 초음파추출, 상온교반과 초음파 후 환류냉각추출등 7가지 방법을 비교하였다. 루틴 함량에서 7가지 추출방법은 통계적으로 유의한 차이를 보였으나, 퀘세틴 함량에서 추출방법간 유의차가 없었다.
- 각 수준에 대한 분석 정밀성은 측정된 농도의 상대적 표준편차(relative standard deviation, RSD)로 판단하였는데, 표준편차(SD)에 평균값(mean of calculated concentration, Cm)으로 나누어 준 후 퍼센트(%)로 나타내었다. 표준물질 정밀성 검증을 위해 일일 5반복으로 일내 반복성(intra-day repeatability)을 실시하고, 같은 추출물을 3일 동안 연속적으로 3반복으로 분석하여 일간 정밀성(inter-dayprecision)을 비교하여 RSD를 계산하여 안정성을 검토하였다.
- UPLC 분석방법을 위해 검출할 수 있는 최소량을 알기 위한검출한계(limits of detection, LOD)와 UPLC방법으로 루틴과 퀘세틴의 정량 분석이 가능한 최소한의 농도를 알기 위한 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 구하였다. 표준물질의 LOD와LOQ는 계산식은 표준편차(SD) 값에 각각 3.3과 10.0을 곱한 후선형 회귀식에서 구한 평균 기울기값(Sa)으로 나누어서 구하였다.
- 플라보노이드정량 분석을 위해 UV 검출기(detector)를 장착한 UPLC (AcquityUPLC I-Class, Waters Corporation) 기기와 분석칼럼(AcquityUPLC CSH C18, 2.1 mm i,d, 100 mm length, 1.7 μm particlesize)을 사용하였다.
- 효율적인 쓴메밀 추출방법을 찾고자 논문으로 보고된 메밀 추출방법을 참고하여(13,14,18,19) 7가지 추출방법을 1차 실험에서 9반복으로 하여 4차 실험까지 총 36반복으로 수행하였다. 쓴메밀종자 분쇄시료 1g에 100% 메탄올을 가한 후 환류냉각추출(refluxextraction, RE), 초음파추출(ultrasonification, UE), 상온교반추출(stirrer extraction, SE), 초음파 후 환류냉각추출(reflux extractionafter ultrasonification, URE), 상온교반 후 환류냉각추출(refluxextraction after stirrer extraction, SRE), 상온교반후 초음파추출(ultrasonification after stirrer extraction, SUE), 상온교반과 초음파후 환류냉각추출(reflux extraction with ultrasonification after stirrer extraction, SURE)로 단독 또는 혼용으로 추출하는 방법으로수행하였다(Table 1).
대상 데이터
- 관측에 사용된 검출파장(detection wavelength)은 259 nm이고, 시료주입량은 1 μL로 하였다.
- 본 연구에 사용한 표준물질로 루틴(rutin, 순도 99%)과 퀘세틴(quercetin, 순도 99%)은 Extrasynthese (Genay, France)에서 구입하였다. 분석에 사용된 모든 시약은 HPLC 순도로 아세토나이트릴과 메탄올은 Tedia Company (Cincinnati, OH, USA), 포름산(formic acid)은 Sigma-Aldrich Company (St.
- 본 연구에서 사용한 쓴메밀 종자 시료는 강원도 평창군 진부면(북위 37.615°, 동경 128.551°, 560 masl) 실험포장에서 2015년5월에 파종하여 8월에 수확하여 20±5℃ 조건에서 한달간 자연건조한 후 분쇄기(Grinder SFM-555 SP, Shinil Co., Seoul, Korea)를 이용하여 마쇄한 후 40 mesh 체로 거른 후 분말을 분석에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 표준물질로 루틴(rutin, 순도 99%)과 퀘세틴(quercetin, 순도 99%)은 Extrasynthese (Genay, France)에서 구입하였다. 분석에 사용된 모든 시약은 HPLC 순도로 아세토나이트릴과 메탄올은 Tedia Company (Cincinnati, OH, USA), 포름산(formic acid)은 Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, USA)에서구입하였다. 증류수는 초순수증류수제조기(Milli-Q system, Millipore, Bedford, MO, USA)의 정제 시스템에서 초순수를 받아 사용하였다.
데이터처리
- 4)Significant differences were analyzed by Duncan’s multiple range test at p<0.05 for seven extraction methods.
- 7가지 추출방법별 쓴메밀 종자의 루틴과 퀘세틴 함량을 통계패키지 ‘R analysis’를 사용하여 상자그림으로 나타내었다(Fig. 3).
- Significant differences were analyzed by Duncan’s multiple range test at p<0.05 for each seven extraction methods: reflux extraction (RE), ultra-sonification (UE), stirrer extraction (SE), reflux extraction after ultra-sonification (UE+RE), reflux extraction after stirrer extraction (SE+RE), ultra-sonification after stirrer extraction (SE+UE), and reflux extraction with ultra-sonification after stirrer extraction (SE+UE+RE).
- 각 수준에 대한 분석 정밀성은 측정된 농도의 상대적 표준편차(relative standard deviation, RSD)로 판단하였는데, 표준편차(SD)에 평균값(mean of calculated concentration, Cm)으로 나누어 준 후 퍼센트(%)로 나타내었다. 표준물질 정밀성 검증을 위해 일일 5반복으로 일내 반복성(intra-day repeatability)을 실시하고, 같은 추출물을 3일 동안 연속적으로 3반복으로 분석하여 일간 정밀성(inter-dayprecision)을 비교하여 RSD를 계산하여 안정성을 검토하였다.
- 각 시료에 대한 실험결과는 평균값과 표준편차로 나타내었으며, 통계패키지 SAS(Ver. 9.2 for Windows, SAS Institute, Cary,NC, USA)를 이용하여 분산분석을 실시하고 실험군 간의 유의적차이검증은 Duncan’s multiple range test를 이용해서 p<0.05 수준에서 분석하였다.
- 05 수준에서 분석하였다. 또한, 통계패키지 R analysis (R i386 3.3.2)를사용하여 정보를 시각화하여 쉽게 알 수 있게 하여 효과적으로 데이터를 파악하고자 상자그림(box and whisker plot)으로 표현하였으며, 최대값(maximum), 최소값(minimum), 중앙값(median), 평균값(mean), 사분위수범위(interquartile range, IQR), 및 이상치(outlier) 등의 기초통계량을 나타내었다(Fig. 2). 하위 1사분위수(제 1사분위수, 아래에서 25% 백분위 점에 위치하는 수, Q1), 상위 3분위(제 3사분위수, 아래에서 75% 백분위 점에 위치하는 수, Q3)을 상자로 나타내었다.
- 본 연구에서는 ICH Q2B 유효성 검증방법에 따라 선형성(linearity), 정밀성(precision), 정확도(accuracy)를 확인하였다(21,22).루틴과 퀘세틴 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질농도별(0.10, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80 mg/mL)로 15반복으로 UPLC로분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient ofdetermination, r)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여y=ax+b값을 계산하였다
- 즉, 하루동안 7가지 추출방법을 9반복으로 수행하여 총 4회 분석하여 일내 반복성을 구하였고, 1일 1구간으로 하여 같은 샘플을5일동안 연속적으로 UPLC를 이용하여 일간정밀성을 분석하였다. 분석을 통해 얻어진 면적은 보정선에 의해 정량한 농도별 검출농도의 표준편차를 검출농도 평균으로 나눈 비율의 백분율(RSD,%)로 나타내었다. 그 결과, 모든 처리에서 루틴과 퀘세틴의 RSD는 10%이하를 나타내었다.
성능/효과
- 결론적으로, 환류냉각추출은 루틴과 퀘세틴을 분석하는데 빠르고 안정적이면서도 효율적임이 확인되었다. 따라서 이 방법은 식품의 함량 분석뿐만 아니라 육종 프로그램에서 요구되는 대규모계통을 스크리닝하는데 유용할 것으로 기대된다.
- 분석을 통해 얻어진 면적은 보정선에 의해 정량한 농도별 검출농도의 표준편차를 검출농도 평균으로 나눈 비율의 백분율(RSD,%)로 나타내었다. 그 결과, 모든 처리에서 루틴과 퀘세틴의 RSD는 10%이하를 나타내었다. 환류냉각추출의 루틴 함량의 일내와일간 RSD는 각각 3.
- 또한 UPLC 방법을 사용함으로써 분석시간을 HPLC 분석의 37-61분(11,17)에서 23분으로 대폭 단축하였다. 그 결과, 소량의 퀘세틴도 효과적으로 검출할 수 있는 수준으로 추출효율이 크게 향상되었으며 분석시간도 대폭 단축되었다
- 79%의 범위를 나타내어 본 연구결과와 유사한 경향이었다(25). 따라서, 본 연구에서 루틴과 퀘세틴의 정밀성은3.5% 이내로 일내와 일간의 반복성과 재현성이 우수함을 확인하였다. 또한, 각 수준에 대한 분석 정밀성은 일간 및 일내 RSD로 결정되는데, 정밀성이 15 % 미만이어야 한다는 기존의 연구 보고(26)와도 부합되었다.
- 4%로 국제적 회수율 권고치 기준에 부합하였다. 따라서, 쓴메밀 루틴 추출방법으로는 추출 소요시간이 1시간 이내로 짧으면서 루틴 함량이 가장 안정적으로 많이 추출되는 환류냉각추출이 가장 적합하였다.
- 환류냉각추출의 루틴 함량에 대한 중앙값은 2,306 mg/100 g으로 다른 추출방법에 의한 값들보다 높았으며, 사분위범위수도 2,232-2,347 mg/100 g으로 좁게나타났다. 따라서, 환류냉각추출방법은 안정적으로 분석되어 높은 효율을 나타내는 최적 추출법으로 판단되었다.
- 추출방법으로 환류냉각추출, 초음파추출, 상온교반추출, 초음파후 환류냉각추출, 상온교반 후 환류냉각추출, 상온교반후 초음파추출, 상온교반과 초음파 후 환류냉각추출등 7가지 방법을 비교하였다. 루틴 함량에서 7가지 추출방법은 통계적으로 유의한 차이를 보였으나, 퀘세틴 함량에서 추출방법간 유의차가 없었다. 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출방법 중 함량이 가장 많아 추출수율이 높았으며 검출횟수도 가장 높았다.
- 0mg/mL)로 준비한 후 환류냉각추출한 샘플을 혼합하여 3반복으로 분석하였으며, 이론적 농도과 실제 측정농도를 구하여 회수율을계산하였다(Table 5). 루틴과 퀘세틴의 회수율은 각각 98.2-102.7%,87.4-91.6%의 범위를 보였으며, 오차는 15% 이내를 만족하였다. Jeon 등(25)은 양파 퀘세틴 분석시 82.
- 반면, 초음파 추출의 경우 루틴과 퀘세틴 함량 평균값은 각각2,015, 135 mg/100 g으로 처리구 중 가장 낮았으며, 퀘세틴 검출회수도 36회 중 20회로 가장 적었다. 또한 초음파추출의 루틴 함량에 대한 최소값이 1,782 mg/100 g로 낮았으며, 중앙값도1,952 mg/100 g로 가장 낮았다.
- 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출방법 중 함량이 가장 많아 추출수율이 높았으며 검출횟수도 가장 높았다. 반면, 초음파 추출의 루틴과 퀘세틴의 함량이 처리구 중 가장 낮았으며, 검출횟수도 가장 적었다. 환류냉각추출에서 일내 반복성(intra-day repeatablility)과일간 정밀성(inter-day precision)은 상대적 표준편차(relative standarddeviation, RSD)가 0.
- 예를 들면, 80℃ 고온에서 환류냉각추출을 짧은 시간 실시하여도 25℃ 상온 및 5℃ 저온에서 장기간(24시간) 추출하는 것보다 루틴 추출이 용이하다고 하였다(18). 본연구에서 환류냉각추출시 추출 수율이 높은 것은 열에 의하여 불용성 성분들이 가용성화 됨에 따라 용출이 용이하게 된 결과라 판단되며, 25℃ 상온교반추출에서 추출시간 대비 높은 수율을 나타내는 점으로 볼 때 적정 고온의 온도 처리에 의한 추출법이 효과적일 것으로 판단된다.
- 또한 초음파추출의 루틴 함량에 대한 최소값이 1,782 mg/100 g로 낮았으며, 중앙값도1,952 mg/100 g로 가장 낮았다. 상온교반 후 환류추출이나 초음파추출과 같은 혼용처리의 경우 루틴 함량 범위는 2,016-2,184 mg/100 g, 퀘세틴 함량 범위는 148-154 mg/100 g로 나타났으며, 퀘세틴 검출회수 범위는 36회 중 24-25회로 나타났다. 상온교반 후환류추출방법은 환류추출보다 성분 함량에서 다소 적었으나, 초음파나 상온교반추출보다는 함량이 많아 이들 두 단독처리보다는 효과적인 것으로 나타났다.
- 상온교반 후 환류추출이나 초음파추출과 같은 혼용처리의 경우 루틴 함량 범위는 2,016-2,184 mg/100 g, 퀘세틴 함량 범위는 148-154 mg/100 g로 나타났으며, 퀘세틴 검출회수 범위는 36회 중 24-25회로 나타났다. 상온교반 후환류추출방법은 환류추출보다 성분 함량에서 다소 적었으나, 초음파나 상온교반추출보다는 함량이 많아 이들 두 단독처리보다는 효과적인 것으로 나타났다. 상온교반과 초음파 후 환류냉각추출법 즉, 3가지를 혼용한 추출은 이상치(outlier)가 7개로 가장 많아 안정적인 추출법으로 적합하지 않았다.
- 6%로 가장 높아 안정적인지 못한 것으로 판단되었다. 상온교반추출의 일내 및 일간의 루틴 함량에 대한 RSD는 각각 2.6, 3.2%로 안정적이었으나 다른 추출방법에 비해 함량이 낮아 고효율 추출법으로 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
- 이상의 결과, 본 연구에서의 유효성 검정 결과를 요약하면 다음과 같다. 선형성은 본문에서 제시한 측정농도 범위에서 모두0.999 이상의 감응 상관관계를 나타내었으며, 최대검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.0210, 0.6350 mg/mL이었다. 일내반복성과 일간정밀성에서 RSD는 4% 이하였으며 회수율은 89-102%으로 매우 우수하였다.
- 일내반복성과 일간정밀성에서 RSD는 4% 이하였으며 회수율은 89-102%으로 매우 우수하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 제시한 분석방법이 루틴과 퀘세틴 분석에 있어 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 연구에서는 다양한 추출방법을 대상으로 정밀성을 분석하고, 유효성 검정을 실시하여 쓴메밀의 루틴과 퀘세틴 함량을 분석하는데 적합한 추출방법인 환류냉각추출방법을 선발하였다.
- 0621 mg/mL이었다. 이상의 검증 결과는 쓴메밀 종자의루틴과 퀘세틴의 분석에 선발된 환류냉각추출방법이 안정적으로 적용 가능함을 알 수 있었다.
- 6350 mg/mL이었다. 일내반복성과 일간정밀성에서 RSD는 4% 이하였으며 회수율은 89-102%으로 매우 우수하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 제시한 분석방법이 루틴과 퀘세틴 분석에 있어 유용하다는 것을 의미한다.
- 3).추출방법 간 통계적 유의성 검정에서 루틴함량은 유의한 차이를보였으나, 반면, 퀘세틴 함량에서 추출방법간 유의차가 보이지 않았다. 추출방법 중 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량의 평균값은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출수율이 높았으며 퀘세틴 검출횟수도 36회 중 28회로 가장 많았다.
- 추출방법 간 통계적 유의성 검정에서 루틴함량은 유의한 차이를보였으나, 반면, 퀘세틴 함량에서 추출방법간 유의차가 보이지 않았다. 추출방법 중 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량의 평균값은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출수율이 높았으며 퀘세틴 검출횟수도 36회 중 28회로 가장 많았다. 환류냉각추출의 루틴 함량에 대한 중앙값은 2,306 mg/100 g으로 다른 추출방법에 의한 값들보다 높았으며, 사분위범위수도 2,232-2,347 mg/100 g으로 좁게나타났다.
- 한편 초음파추출의 경우 루틴의 일내와 일간 RSD는 각각 6.2,6.8%였으며, 퀘세틴의 일내와 일간 측정 RSD는 각각 0.5, 0.6%로 가장 높아 안정적인지 못한 것으로 판단되었다. 상온교반추출의 일내 및 일간의 루틴 함량에 대한 RSD는 각각 2.
- 추출방법 중 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량의 평균값은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출수율이 높았으며 퀘세틴 검출횟수도 36회 중 28회로 가장 많았다. 환류냉각추출의 루틴 함량에 대한 중앙값은 2,306 mg/100 g으로 다른 추출방법에 의한 값들보다 높았으며, 사분위범위수도 2,232-2,347 mg/100 g으로 좁게나타났다. 따라서, 환류냉각추출방법은 안정적으로 분석되어 높은 효율을 나타내는 최적 추출법으로 판단되었다.
- 그 결과, 모든 처리에서 루틴과 퀘세틴의 RSD는 10%이하를 나타내었다. 환류냉각추출의 루틴 함량의 일내와일간 RSD는 각각 3.0, 3.2%였으며, 퀘세틴의 일내와 일간 RSD는 각각 0.6, 0.4%로 낮아 반복성과 재현성이 우수함을 확인하였다.
- 루틴 함량에서 7가지 추출방법은 통계적으로 유의한 차이를 보였으나, 퀘세틴 함량에서 추출방법간 유의차가 없었다. 환류냉각추출의 루틴과 퀘세틴 함량은 각각 2,277, 158 mg/100 g으로 추출방법 중 함량이 가장 많아 추출수율이 높았으며 검출횟수도 가장 높았다. 반면, 초음파 추출의 루틴과 퀘세틴의 함량이 처리구 중 가장 낮았으며, 검출횟수도 가장 적었다.
후속연구
- 결론적으로, 환류냉각추출은 루틴과 퀘세틴을 분석하는데 빠르고 안정적이면서도 효율적임이 확인되었다. 따라서 이 방법은 식품의 함량 분석뿐만 아니라 육종 프로그램에서 요구되는 대규모계통을 스크리닝하는데 유용할 것으로 기대된다.
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