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문제 정의
- 끝으로 본 혼합물에 대한 피부자극 완화효과에 대해 평가하였다. 이를 위해 피부 자극 물질로서 SLS를 처치하였고, 혼합물과 함께 IQ chamberⓇ를 이용한 피부 첩포 시험을 실시하였다.
- 본 연구는 각질형성세포에 LPS를 처리 시 염증 유발인자가 증가함을 확인하고, 동일 실험 조건에서 염증 유발인자의 발현을 효과적으로 억제함으로써 외부자극에 의해 유발되는 피부자극 및 피부염의 발생을 억제하거나 개선시키는 화장품 소재를 개발하고자 하였다. 이를 위해 먼저 문헌적으로 항염 효과가 있는 것으로 보고된 약 60여 종의 천연물 소재를 확보한 후세포독성 여부, DPPH 라디컬 소거능, NO 생성 억제능, 염증 유발 사이토카인의 발현 억제능 등에 대한 평가를 실시하였고, 최종적으로 염증 유발 사이토카인으로서 IL-1α, TNF-α, IL-6 및 IL-8에 대해 유의한 억제효능을 보인 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자 추출물 등 4종의 효능 원료를 발굴하였다.
- 01). 이에 마가목, 쐐기풀, 죽여, 오배자 추출물을 피부자극완화를 위한 항염소재로서 선정하여, 본 4종의 혼합물에 대한 항염 및 피부자극완화 효과에 대한 평가를 진행하였다.
- 이에 본 연구에서는 피부 자극 시에 초기 염증 유발 사이토카인인 IL-1α, TNF-α, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제하는데 초점을 두고, 이에 효과적인 천연물을 발굴하고자 하였고, 염증 유발의 초기 작용기전을 억제함으로써 피부자극 완화효과를 줄 수 있을 것으로 기대하였다.
- 따라서, 피부 자극에 따른 초기 염증 유발 인자를 타겟으로 새로운 자극 완화 소재를 개발함으로써 보다 안전한 화장품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 연구에서는 피부자극으로 인해 증가되는 대표적인 염증 유발 사이토카인 및 그 외 염증 매개 효소의 발현을 억제시킴으로써 결과적으로 자극완화에 효능 있는 천연 소재를 발굴하고자 하였다. 이를 위해 문헌조사를 통해 확보한 약 60여 종의 항염 소재에 대하여 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 통한 독성 평가, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디컬 소거 효과, NO 생성 억제 효과, IL-1α, TNF-α, IL-6, 및 IL-8의 염증 유발 사이토카인 생성 억제 효과 등을 통해 최종적으로 4가지 원료를 선정하였고, 이들 원료에 대한 혼합물을 조합하여, 이의 항염증 효능을 확인하였다.
제안 방법
- 4가지 원료의 혼합에 대한 최적 혼합 비율을 찾기 위해서 자극에 대한 초기 염증 유발 사이토카인인 IL-α와 TNF-α의 발현 억제 효과를 real-time PCR을 통해 확인하였다.
- 1세였다. 70% ethanol로 시험 부위를 세척하고 건조시킨 후, IQ chamberⓇ (Chemotechni-que Diagnostics, Sweden)를 이용하여 팔 전박 부위에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 피부 첩포는 24 h 동안 진행하고, 첩포를 제거한 후에는 marking pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30 min, 24 h에 시험부위의 피부자극 여부를 판정하였다.
- HaCaT 세포는 96 well plate에 2 × 104 cells/well 농도로 분주하고 24 h 후에 혈청제거(serum free) 배지로 교환한 후, 각각의 추출물을 1, 10, 50, 100 µg/mL 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
- Nanodrop 2000(Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량하였고, total RNA 2 µg을 DEPC와 함께 70℃에서 5 min 동안 가열시킨 후 oligo (dT)를 포함한 Reverse Transcription Premix (ELPIS-Biotech, Korea)에 넣고 최종 부피가 20µL가 되도록 하였다.
- 다음으로 IL-1α와 TNF-α에 대한 항염 효과가 높은 혼합 비율에 맞춰 혼합 추출물을 제조한 후, 염증 유발 사이토카인에 대한 농도에 따른 효과를 평가하였다.
- 이를 위해 문헌조사를 통해 확보한 약 60여 종의 항염 소재에 대하여 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 통한 독성 평가, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디컬 소거 효과, NO 생성 억제 효과, IL-1α, TNF-α, IL-6, 및 IL-8의 염증 유발 사이토카인 생성 억제 효과 등을 통해 최종적으로 4가지 원료를 선정하였고, 이들 원료에 대한 혼합물을 조합하여, 이의 항염증 효능을 확인하였다. 또한, 최종적으로 선정된 혼합물에 대한 피부자극 완화시험을 실시하였다.
- 마가목(Sorbus commixta, SC)의 수피, 쐐기풀(Urticadioica, UD)의 잎, 죽여(Phyllostachys nigra, PN) 및 붉나무의 충영인 오배자(Rhus semialata gall, RS)의 개별 원료 분말을 각각 100 g씩 취하여 각각 별개의 용기에 넣고, 추출용매로서 70% 에탄올 수용액 1 L에 침적하여 24 h 동안 실온에 방치하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 여과지를 이용하여 여과를 한 다음, 여액을 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 각각의 농축 추출물을 얻었다.
- 상기 혼합 비율에 따른 혼합물을 1, 10 µg/mL의 농도로 LPS 0.5 µg/mL와 함께 각질형성세포에 처리한 후 COX-2, iNOS의 발현정도를 real-time PCR를 이용하여 측정하였다.
- 세포는 penicillin (100 units/mL) / streptomycin (100 µg/mL)과 10% FBS가 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, Thermo, USA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2 - 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
- 얻어진 cDNA로부터 TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1α, COX-2, iNOS, β-actin을 증폭시키기 위해 DEPC로 5배 희석시킨 cDNA 2µL를 primer 0.5 µL, DEPC water 7 µL, SYBR green Master Mix (Invitrogen Life Technology, USA) 10 µL와함께 StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 마가목(Sorbus commixta, SC)의 수피, 쐐기풀(Urticadioica, UD)의 잎, 죽여(Phyllostachys nigra, PN) 및 붉나무의 충영인 오배자(Rhus semialata gall, RS)의 개별 원료 분말을 각각 100 g씩 취하여 각각 별개의 용기에 넣고, 추출용매로서 70% 에탄올 수용액 1 L에 침적하여 24 h 동안 실온에 방치하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 여과지를 이용하여 여과를 한 다음, 여액을 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 각각의 농축 추출물을 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 피부 자극 시에 초기 염증 유발 사이토카인인 IL-1α, TNF-α, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제하는데 초점을 두고, 이에 효과적인 천연물을 발굴하고자 하였고, 염증 유발의 초기 작용기전을 억제함으로써 피부자극 완화효과를 줄 수 있을 것으로 기대하였다. 이를 위해 각 사이토카인 별로 발현 억제효과가 높았던 천연물을 선택하여 최종적으로 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자 추출물 등 총 4종의 천연물을 발굴하였다. 이어 외부 자극 물질에 의한 염증 유발 과정의 개시 인자인 IL-1α과 TNF-α[22,23]을 억제하는 최적 혼합 비율을 찾은 후 혼합물에 대한 각 사이토카인 별로 발현 억제효과를 확인한 결과, 모든 사이토카인에 대해 매우 유의한 억제효과를 확인할 수 있었다.
- 이를 위해 먼저 문헌적으로 항염 효과가 있는 것으로 보고된 약 60여 종의 천연물 소재를 확보한 후세포독성 여부, DPPH 라디컬 소거능, NO 생성 억제능, 염증 유발 사이토카인의 발현 억제능 등에 대한 평가를 실시하였고, 최종적으로 염증 유발 사이토카인으로서 IL-1α, TNF-α, IL-6 및 IL-8에 대해 유의한 억제효능을 보인 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자 추출물 등 4종의 효능 원료를 발굴하였다.
- 이를 위해 문헌조사를 통해 확보한 약 60여 종의 항염 소재에 대하여 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 통한 독성 평가, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디컬 소거 효과, NO 생성 억제 효과, IL-1α, TNF-α, IL-6, 및 IL-8의 염증 유발 사이토카인 생성 억제 효과 등을 통해 최종적으로 4가지 원료를 선정하였고, 이들 원료에 대한 혼합물을 조합하여, 이의 항염증 효능을 확인하였다.
- 끝으로 본 혼합물에 대한 피부자극 완화효과에 대해 평가하였다. 이를 위해 피부 자극 물질로서 SLS를 처치하였고, 혼합물과 함께 IQ chamberⓇ를 이용한 피부 첩포 시험을 실시하였다. 그 결과, 각각의 단일 천연물을 처리하였을 때 보다 4종의 혼합물을 처리하였을 때 가장 높은 자극 완화 효과를 나타냈다.
- 이어 선별된 33종에 대하여 LPS로 유도한 IL-1α, TNF-α, IL-6, 및 IL-8 등의 염증 유발 사이토카인의 발현에 대한 평가를 실시하였다(결과 생략).
- 이어 염증 유발 효소인 COX-2와 iNOS에 대한 혼합물의 영향을 평가하였다. 상기 혼합 비율에 따른 혼합물을 1, 10 µg/mL의 농도로 LPS 0.
- 70% ethanol로 시험 부위를 세척하고 건조시킨 후, IQ chamberⓇ (Chemotechni-que Diagnostics, Sweden)를 이용하여 팔 전박 부위에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 피부 첩포는 24 h 동안 진행하고, 첩포를 제거한 후에는 marking pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30 min, 24 h에 시험부위의 피부자극 여부를 판정하였다. 0.
대상 데이터
- Cell lines service (Eppelheim, Germany)로부터 human keratinocyte cell line인 HaCaT를 구입하였다. 세포는 penicillin (100 units/mL) / streptomycin (100 µg/mL)과 10% FBS가 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, Thermo, USA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2 - 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
- 문헌에서 확인된 약 60여 종의 항염소재에 대해 먼저 keratinocyte에 대한 세포 독성시험, DPPH 라디컬 소거능, NO 생성 억제 효과를 실시하였고, 세포 독성이 없고, 항산화 효능 및 NO 생성을 억제하는 33종의 소재를 선별하였다(결과 생략).
- 피시험자 총 31명이 시험 과정에 참여하였으며, 평균연령은 32.4 ± 3.1세였다.
데이터처리
- 모든 통계분석은 t-test를 실시하여 평가하였다. 두 군 간의 차이에 의한 통계적 검정 후 p 값이 0.
이론/모형
- 또한, COX-2의 발현 억제와 함께 PGE2의 발현도 감소하는지 확인하기 위해 LPS 처리에 따른 PGE2 발현량을 ELISA 방법으로 평가하였다. COX-2는 염증 매개물질인 PGE2 발현을 유도한다[14].
- 마가목, 쐐기풀, 죽여, 오배자 추출물의 HaCaT cell에 대한 독성 평가를 위해 MTT assay를 수행하였다. HaCaT 세포는 96 well plate에 2 × 104 cells/well 농도로 분주하고 24 h 후에 혈청제거(serum free) 배지로 교환한 후, 각각의 추출물을 1, 10, 50, 100 µg/mL 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
- 위 시험법은 Frosch & Kligman, CTFA guideline에 제시된 terminology에 의거하여 검사하였다[19,20].
- 위 시험법은 Frosch & Kligman, CTFA guideline에 제시된 terminology에 의거하여 검사하였다[19,20]. 피부 첩포시험 결과 판정표(Table 2)에 따라 자극유무를 판정하였고, 평균 피부반응도(Mean score)는 아래의 일반적인 계산공식에 따라 산정하였다. 본 실험은 기관생명윤리위원회의 심의를 거쳐 규정에 맞게 시행되었으며, 각각의 지원자들에게 알맞은 설명 후 서명을 받고 진행되었다.
성능/효과
- HaCaT 세포에 LPS를 처리하였을 때 COX-2와 iNOS의 mRNA 발현양이 각각 3.15배, 2.05배 정도 증가하였고, 혼합물 처리에 따라 농도 의존적으로 유의한 발현 억제 효과를 확인하였다(Figure 4a, b, p < 0.01).
- 그 결과, Figure 1전에 나타낸 것과 같이 각 사이토카인에서 LPS 처리 시 증가하는 mRNA의 발현을 유의하게 억제시키는 마가목, 죽여, 쐐기풀, 오배자 추출물을 발굴하였다(p < 0.01).
- 그 결과, LPS로 유발한 IL-1α, TNF-α, IL-6, IL-8 모두에서 본 혼합 비율에 따른 혼합물을 처리 시 농도 의존적으로 유의한 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다(p < 0.01).
- 이를 위해 피부 자극 물질로서 SLS를 처치하였고, 혼합물과 함께 IQ chamberⓇ를 이용한 피부 첩포 시험을 실시하였다. 그 결과, 각각의 단일 천연물을 처리하였을 때 보다 4종의 혼합물을 처리하였을 때 가장 높은 자극 완화 효과를 나타냈다. 따라서, 앞서 실험 결과와 함께 종합적으로 볼 때 본 연구에 따른 4종의 혼합물은 제품에 적용될 시 피부자극 완화 효과를 줄 것으로 기대된다(Figure 5).
- 이를 위해 먼저 문헌적으로 항염 효과가 있는 것으로 보고된 약 60여 종의 천연물 소재를 확보한 후세포독성 여부, DPPH 라디컬 소거능, NO 생성 억제능, 염증 유발 사이토카인의 발현 억제능 등에 대한 평가를 실시하였고, 최종적으로 염증 유발 사이토카인으로서 IL-1α, TNF-α, IL-6 및 IL-8에 대해 유의한 억제효능을 보인 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자 추출물 등 4종의 효능 원료를 발굴하였다. 또한, 이들 천연물을 조합한 혼합물에 대해서 염증 유발 사이토카인의 발현이 유의하게 억제되고, 염증 반응을 유도하는 COX-2, iNOS 및 PGE2의 발현도 유의하게 억제됨을 확인하였다. 최종적으로는 피부 첩포 시험을 통해 SLS로 유도한 피부자극에서 피부자극 유발을 효과적으로 억제함을 확인하였다.
- 이어 외부 자극 물질에 의한 염증 유발 과정의 개시 인자인 IL-1α과 TNF-α[22,23]을 억제하는 최적 혼합 비율을 찾은 후 혼합물에 대한 각 사이토카인 별로 발현 억제효과를 확인한 결과, 모든 사이토카인에 대해 매우 유의한 억제효과를 확인할 수 있었다. 또한, 최적 조합에 따른 4종의 혼합물은 대표적인 염증 유발 효소인 COX-2, iNOS 및 PGE2에 대해서도 유의한 억제효과를 보였다. 마지막으로 피부자극시험을 통해서 최적 조합에 따른 4종의 혼합물이 단일 천연물보다 자극완화효과가 높음을 확인하였다.
- 또한, 최적 조합에 따른 4종의 혼합물은 대표적인 염증 유발 효소인 COX-2, iNOS 및 PGE2에 대해서도 유의한 억제효과를 보였다. 마지막으로 피부자극시험을 통해서 최적 조합에 따른 4종의 혼합물이 단일 천연물보다 자극완화효과가 높음을 확인하였다.
- 이어 외부 자극 물질에 의한 염증 유발 과정의 개시 인자인 IL-1α과 TNF-α[22,23]을 억제하는 최적 혼합 비율을 찾은 후 혼합물에 대한 각 사이토카인 별로 발현 억제효과를 확인한 결과, 모든 사이토카인에 대해 매우 유의한 억제효과를 확인할 수 있었다.
- 최종 처리 농도는 10 µg/mL로 4가지 원료를 Table 3과 같은 비율로 혼합하여 시행하였고, LPS로 유발한 IL-1α와 TNF-α의 발현 정도를 확인한 결과, 마가목, 쐐기풀, 죽여, 오배자의 비율이 1:1:1:1 (#1)과 1:1:1:2(#5)인 경우에 LPS 단독 처리 군과 유의한 차이를 보였고(p < 0.01), 그중 #5에서 가장 큰 저해 효과를 나타냈다(Figure 2).
- 또한, 이들 천연물을 조합한 혼합물에 대해서 염증 유발 사이토카인의 발현이 유의하게 억제되고, 염증 반응을 유도하는 COX-2, iNOS 및 PGE2의 발현도 유의하게 억제됨을 확인하였다. 최종적으로는 피부 첩포 시험을 통해 SLS로 유도한 피부자극에서 피부자극 유발을 효과적으로 억제함을 확인하였다.
후속연구
- 따라서, 본 연구에서와 같이 초기 염증 유발 사이토카인을 타겟으로 항염 및 자극완화 소재를 발굴하는 방법은 새로운 소재 개발을 위해 매우 유용한 방법에 하나로 제안될 수 있다고 생각된다. 아울러 본 연구로 개발된 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자의 혼합 추출물은 피부염 유발을 억제하고, 민감성 피부 등을 위한 자극완화용 화장품 소재로서 유용할 것으로 기대된다.
- 그 결과, 각각의 단일 천연물을 처리하였을 때 보다 4종의 혼합물을 처리하였을 때 가장 높은 자극 완화 효과를 나타냈다. 따라서, 앞서 실험 결과와 함께 종합적으로 볼 때 본 연구에 따른 4종의 혼합물은 제품에 적용될 시 피부자극 완화 효과를 줄 것으로 기대된다(Figure 5).
- 이를 위해 피부자극과 염증 발생을 억제하는 천연물 유래의 소재는 화장품 소재로서 많은 이점을 제공한다. 따라서, 피부 자극에 따른 초기 염증 유발 인자를 타겟으로 새로운 자극 완화 소재를 개발함으로써 보다 안전한 화장품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 연구에서는 피부자극으로 인해 증가되는 대표적인 염증 유발 사이토카인 및 그 외 염증 매개 효소의 발현을 억제시킴으로써 결과적으로 자극완화에 효능 있는 천연 소재를 발굴하고자 하였다.
- 따라서, 본 연구에서와 같이 초기 염증 유발 사이토카인을 타겟으로 항염 및 자극완화 소재를 발굴하는 방법은 새로운 소재 개발을 위해 매우 유용한 방법에 하나로 제안될 수 있다고 생각된다. 아울러 본 연구로 개발된 마가목, 쐐기풀, 죽여 및 오배자의 혼합 추출물은 피부염 유발을 억제하고, 민감성 피부 등을 위한 자극완화용 화장품 소재로서 유용할 것으로 기대된다.
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