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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 검은콩 물과 에탄올 추출물 및 유산균 2종[Lactobacillus rhamnosus GG(LGG), Bifidobacterium animals subsp. lactis BB-12(BB-12)]을 이용하여 발효시킨 검은콩의 물과 에탄올 추출물의 이화학적 분석을 통해 발효를 통한 이인간 모유두 세포(human follicle dermal papilla cell, HFDPC) 성장에 미치는 효과와 그 기전을 비교 분석해 보고자 한다.
- 동물 모델을 이용한 실험 결과를 통해 모발 건강 및 성장에 미치는 영향을 예측할 수 있으나 이러한 연구 결과를 토대로 한 인간 primary 모유두 세포를 이용한 추가적인 연구가 필요할 것이라 생각된다. 이에 본 연구에서는 검은콩 추출물과 프로바이오틱스 유산균 2종(LGG, BB-12)을 이용하여 발효시킨 발효검은콩이 인간 모유두 세포성장에 미치는 효과와 그 기전을 비교 분석함으로써 검은콩과 발효검은콩 추출물의 탈모 예방 및 치료를 위한 천연소재 모발건강 소재로써의 가능성을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- 1에 도식화하였으며 다음과 같다. 검은콩은 수세, 탈수, 동결건조의 과정을 거쳐 분말화한 후, 시료 무게의 30배량(w/v)의 3차 증류수와 70% 에탄올을 각각 첨가하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 물 추출물(black soybean water extract, BWE)은 감압 여과기로 추출하여 2차 동결건조를 시켜 분말형태의 추출물을 얻고, 에탄올 추출물(black soybean ethanol extract, BEE)의 경우 감압여과 후 감압농축기(Heidolph, Schwabach, Germany)를 이용하여 60℃에서 농축시킨 후 2차 동결건조 하여 분말형태의 추출물을 얻어 실험에 처리할 때에는 Dulbecco’s phosphate-buffered saline(DPBS, Gibco, Waltham, MD, USA)에 희석하여 필터를 내린 다음 본 실험에 사용하였다.
- 검은콩 발효에 사용한 유산균은 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG, CHR-Hansen, Roskilde, Denmark)와 Bifidobacterium animals subsp. lactis BB-12 (BB-12, CHR-Hansen)로 위에서 제작한 검은콩 분말에 3차 증류수 10 mL와 LGG, BB-12를 각각 0.1% 혼합하여 37℃ 배양기에서 120시간 동안 발효시킨 후 121℃에서 20분 처리하여 발효를 종료하였다. 물과 에탄올 추출과정은 위에 설명된 바와 동일하게 진행되었으며, 발효검은콩 물추출물(BWE-F)과 에탄올 추출물(BEE-F)을 만들어 본 실험에 사용하였다.
- 1% 혼합하여 37℃ 배양기에서 120시간 동안 발효시킨 후 121℃에서 20분 처리하여 발효를 종료하였다. 물과 에탄올 추출과정은 위에 설명된 바와 동일하게 진행되었으며, 발효검은콩 물추출물(BWE-F)과 에탄올 추출물(BEE-F)을 만들어 본 실험에 사용하였다.
- LGG와 BB-12를 이용하여 발효시킨 검은콩 추출물의 총폴리페놀 함량을 발효진행과정에 따라 24시간 간격으로 5일 동안 측정하였다. Folin-Denis 방법(23)을 응용하여 추출물 시료 1 g을 3차 증류수로 5배씩 희석하여 각 시료 50 μL에 1 M Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(EMD Millipore Corporation, Bedford, MA, USA)를 50 μL 첨가한 후 실온에서 6분간 반응시키고, 이후 2% NaCO3 포화용액 100 μL를 가하여 추가 30분을 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용 하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- LGG와 BB-12를 이용하여 발효시킨 검은콩 추출물의 pH 변화를 알아보기 위하여 발효진행과정에 따라 24시간 간격으로 5일 동안 추출물의 pH를 측정하였다.
- 24-well plate에 HFDPC를 1×105 cells/well의 농도로 seeding 한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 4종의 검은콩 추출물(BWE, BEE, BWE-F, BEEF)을 각각 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 24시간 배양 후상층액을 제거하고, 2 mg/mL의 시약을 100 μL 처리하여 incubator에서 추가로 배양하였다. 이후 상층액을 제거하여 dimethyl sulfoxide를 이용하여 24시간 실온에서 교반한 후, 각 well에 생성된 formazan을 충분히 용해하여 96-well plate에 50 μL씩 분주한 다음 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 2 μL를 microtube에 넣어 반응시켰다. PCR의 전 과정은 95°C에서 3분, 95°C에서 3초, 60°C에서 30초의 구간을 39 cycle 반복하였으며, PCR의 유효성은 melting curve로 검증하였고 각 유전자의 발현은 GAPDH의 발현량으로 표준화하여 비교 분석하였다. 실험에 사용된 primer는 Table 1과 같다.
- 이에 본 연구에서는 HFDPC에서의 BWE, BEE, BWE-F, BEE-F의 처치가 모발 성장 촉진인자 2종(VEGF, KGF/ FGF7)과 모발 성장 억제인자 2종(TGF-β1과 AR)에 미치는 영향을 이들의 mRNA 발현의 비교를 통해 살펴보았다 (Fig. 3).
- 이와 다른 기전으로 Erk는 mitogen-activated protein kinase(MAPK) family 중 하나로 mitogen과 성장인자에 의해 조절되어 세포증식 및 분화 등 다양한 세포반응에 의해 조절된다고 알려져 있다(47). 이에 본 연구에서는 4종의 검은콩 추출물이 HFDPC의 세포생존 및 성장에 미치는 영향을 Akt와 Erk의 인산화 정도로 측정하였다(Fig. 4).
- lactis BB-12(BB-12)를 이용하여 발효시킨 발효검은콩물·에탄올 추출물의 발효 전과 후의 성분변화를 분석하고, 검은콩과 검은콩 발효 추출물이 모유두 세포 성장에 미치는 효과를 알아보기 위해 primary 인간 모유두 세포(HFDPC) 에 검은콩 추출물(BWE, BEE)과 발효검은콩 추출물(BWEF, BEE-F)을 다양한 농도로 처리하여 세포독성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 적정 처치 농도를 결정하여 모발 성장 촉진(VEGF와 KGF/FGF7)과 억제(TGF-β1과 AR)에 관여하는 유전자 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다. 나아가 검은콩 추출물이 HFDPC의 생존 촉진에 미치는 영향을 Akt와 Erk의 인산화 활성을 통해 비교 분석하였다. LGG와 BB-12를 이용하여 발효시킨 검은콩은 발효가 진행됨에 따라 pH, 총폴리페놀, 총당·환원당의 함량이 감소하였으며, 검은콩 4종 추출물(BWE, BEE, BWE-F, BEE-F) 중 BWE, BEE, BWE-F가 VEGF의 mRNA 발현을 증가시키고, 모든 처리군에서 KGF/FGF7의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과 검은콩 물·에탄올 추출물과 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)와 Bifidobacterium animals subsp. lactis BB-12(BB-12)를 이용하여 발효시킨 발효검은콩물·에탄올 추출물의 발효 전과 후의 성분변화를 분석하고, 검은콩과 검은콩 발효 추출물이 모유두 세포 성장에 미치는 효과를 알아보기 위해 primary 인간 모유두 세포(HFDPC) 에 검은콩 추출물(BWE, BEE)과 발효검은콩 추출물(BWEF, BEE-F)을 다양한 농도로 처리하여 세포독성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 적정 처치 농도를 결정하여 모발 성장 촉진(VEGF와 KGF/FGF7)과 억제(TGF-β1과 AR)에 관여하는 유전자 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다. 나아가 검은콩 추출물이 HFDPC의 생존 촉진에 미치는 영향을 Akt와 Erk의 인산화 활성을 통해 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 제주산 검은콩은 제주 전통시장에서 구입하였다. 검은콩 추출물의 제작은 Fig.
- 인간 모유두 세포(PromoCellⓇ, Heidelberg, Germany)는 78세 백인 남성(cell viability: 94%)에게서 채취한 인간 모유두 세포를 본 실험에 사용하였다. 인간 모유두 세포 배양배지는 Human Follicle Dermal Papilla Cell Medium에 FCS(Fetal Calf Serum)와 bovine pituitary extract, basic FGF(fibroblast growth factor)와 인슐린이 포함된 Sup- plement Mix를 혼합하여 제작하였으며, 37°C, 5% CO2가 유지되는 세포배양기(ShelLab, Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 평균±표준오차(SEM)로 표시하였으며 유의적 차이에 대한 해석은 t-test 혹은 ANOVA 분석을 시행하였다. 유의성 차이 검증은 P<0.
- 모든 데이터는 평균±표준오차(SEM)로 표시하였으며 유의적 차이에 대한 해석은 t-test 혹은 ANOVA 분석을 시행하였다. 유의성 차이 검증은 P<0.05 수준에서 실시하였고 사후검정은 Tukey test를 사용하였다(GraphPad Prism Version 6.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
이론/모형
- 발효검은콩의 발효 전후의 총당 및 환원당의 함량 변화를 알아보기 위하여 총당의 함량은 phenol-sulfuric acid법 (24)을 응용하여 측정하였다. 발효진행과정에 따라 24시간 간격으로 5일 동안의 총당과 환원당 함량을 측정하였는데, 시료 1 g을 3차 증류수로 5배씩 희석하여 각 시료 10 μL에 5% 페놀용액 10 μL를 첨가한 후 50 μL의 황산을 가하여 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 위에서 설명된 바와 같이 준비된 검은콩 물 추출물(BWE) 과 알코올 추출물(BEE), 발효검은콩 물 추출물(BWE-F)과 에탄올 추출물(BEE-F)을 HFDPC에 농도별로 처치하였을 때의 독성 여부를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay(26)를 실시하였다. 24-well plate에 HFDPC를 1×105 cells/well의 농도로 seeding 한 후 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 930 μg/mL로 발효 1일차에 유의적으로 낮아지고, 그 후로 큰 변화를 보이지 않았다. 발효검은콩 추출물의 총당 함량은 발효 0일차에서는 4.393 mg/mL, 1일차에서는 3.964 mg/mL, 2일차에서는 3.810 mg/mL, 3일차에서는 2.470 mg/mL, 4일차에서는 1.917 mg/mL, 5일차에서는 1.757 mg/mL로 발효 후 발효 1일차에서는 유의적인 차이가 없었으나 발효 2일차부터 총당의 함량이 유의적으로 낮아졌고, 환원당의 함량은 발효 0일차에서는 1.033 mg/mL, 1일차에서는 0.932 mg/mL, 2일차에서는 0.926 mg/mL, 3일차에서는 0.871 mg/mL, 4일차에서는 0.834 mg/mL, 5일차에서는 0.830 mg/mL로 발효 1일차에 유의적으로 감소한 후 큰 변화를 보이지 않았다.
- 유산균 2종(LGG, BB-12)을 이용하여 발효시킨 검은콩의 총폴리페놀 함량은 발효초기에 가장 높은 함량을 보였으나 발효 1일차에서부터 0.9 μg/mL대로 급격히 감소하였다. 페놀화합물은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있는 방향족 화합물로 단백질 및 기타 거대분자들과 쉽게 결합하여 항산화(29), 항암(30), 항염증 및 항알레르기 작용(31) 등의 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려진 바 있다.
- 식품의 발효에는 단백질뿐만 아니라 전분의 분해도 중요한 인자로 알려져 있다(34). 본 연구에서는 검은콩의 발효과정 중 Lactobacillus와 Bifidobacterium이 분비하는 효소의 작용으로 가수분해되어 콩에 있는 전분이 glucose로 전환 되는 양을 조사하기 위해 발효시간에 따른 총당·환원당의 함량을 측정하였으며, 유산균 2종을 이용하여 검은콩을 발효시킨 결과 발효 전보다 발효 후에 총당과 환원당 함량이 모두 유의적으로 감소하였다. 이는 Eom 등(35)에서 보고한 Bacillus natto 균과 Aspergillus oryzae 균을 각각 이용하여 발효시킨 발아콩 청국장과 혼합균주(Bacillus natto, Aspergillus oryzae)를 이용한 발아콩 청국장이 발효가 진행됨에 따라 총당과 환원당 함량이 모두 감소한다는 결과와 유사하며, Eom 등(35)은 총당과 환원당의 감소가 발효가 진행될수록 당화 amylase 작용에 의해 전분질을 당분으로 분해하고, 동시에 효모의 영양원이나 발효기질로 이용되기 때문이라 보고하였다.
- 2와 같다. HFDPC에 BWE, BEE, BWE-F, BEEF를 0, 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때 BEE군의 가장 높은 농도인 100 μg/mL에서 대조군보다 세포생존율이 121.81%로 BEE의 처치가 HFDPC의 성장에 긍정적인 영향을 주었다. 그러나 BEE를 제외한 나머지 추출물군 (BWE, BWE-F, BEE-F)에서는 세포생존율에 유의적 차이를 주지 않았으며, 더불어 4종의 검은콩 추출물은 HFDPC에 대한 특이적인 독성도 존재하지 않음을 확인하였다.
- 81%로 BEE의 처치가 HFDPC의 성장에 긍정적인 영향을 주었다. 그러나 BEE를 제외한 나머지 추출물군 (BWE, BWE-F, BEE-F)에서는 세포생존율에 유의적 차이를 주지 않았으며, 더불어 4종의 검은콩 추출물은 HFDPC에 대한 특이적인 독성도 존재하지 않음을 확인하였다. 이에 본 실험에서는 HFDPC에서 세포생존에 영향을 미치지 않는 100 μg/mL 농도의 시료를 사용하였다.
- 3). 모발 성장 촉진인자 중 하나인 VEGF는 양성대조군인 minoxidil의 처치에 의해 음성대조군보다 유의적으로 mRNA 발현이 증가하였으며, 검은콩 추출물 4종 중에서 BEE-F군을 제외한 나머지 3종에 의해서도 양성대조군과 유사한 수준으로 mRNA 발현이 증가함을 확인하였다. 또다른 모발 성장 촉진인자인 KGF/FGF7은 음성대조군과 비교하여 양성대조군인 minoxidil을 포함한 모든 4종의 검은콩 추출물 처리군에서 mRNA 발현도가 유의적으로 증가하였다.
- 모발 성장 촉진인자 중 하나인 VEGF는 양성대조군인 minoxidil의 처치에 의해 음성대조군보다 유의적으로 mRNA 발현이 증가하였으며, 검은콩 추출물 4종 중에서 BEE-F군을 제외한 나머지 3종에 의해서도 양성대조군과 유사한 수준으로 mRNA 발현이 증가함을 확인하였다. 또다른 모발 성장 촉진인자인 KGF/FGF7은 음성대조군과 비교하여 양성대조군인 minoxidil을 포함한 모든 4종의 검은콩 추출물 처리군에서 mRNA 발현도가 유의적으로 증가하였다. 특이적으로 BWE의 경우에는 HFDPC에서 minoxidil 군보다도 KGF/FGF7의 mRNA 발현 증가에 효과적임이 관찰되었다.
- Joo(42)의 연구에서 in vitro 실험으로 검은콩이 함유된 식물추출물질(MBN)을 인간 피부각질세포(HaCaT) 에 처치하여 발모와 관련된 유전자의 세포반응을 확인한 결과, VEGF와 KGF의 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 발현도가 보고됨에 따라 본 연구 결과와 유사한 발현 양상을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 검은콩과 발효검은콩 물 추출물의 효과는 HFDPC의 증식 및 이동을 촉진시키는 것은 물론 휴지기의 모발을 성장기로 유도하고 혈관을 확장시켜 혈액순환 개선에 긍정적인 영향을 미칠 것이라 생각된다. 반면 4종의 검은콩 추출물은 HFDPC에서 TGF-β1과 AR의 유전자 발현에 양성대조군인 minoxidil군과는 달리 유의적인 영향을 미치지 못하였다(Fig.
- 나아가 검은콩 추출물이 HFDPC의 생존 촉진에 미치는 영향을 Akt와 Erk의 인산화 활성을 통해 비교 분석하였다. LGG와 BB-12를 이용하여 발효시킨 검은콩은 발효가 진행됨에 따라 pH, 총폴리페놀, 총당·환원당의 함량이 감소하였으며, 검은콩 4종 추출물(BWE, BEE, BWE-F, BEE-F) 중 BWE, BEE, BWE-F가 VEGF의 mRNA 발현을 증가시키고, 모든 처리군에서 KGF/FGF7의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. 나아가 BWE, BEE, BWE-F가 Erk의 활성을 증가시켰음을 확인할 수 있었다.
- 나아가 BWE, BEE, BWE-F가 Erk의 활성을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 따라서 검은콩 물 추출물과 검은콩 에탄올 추출물, 그리고 발효 검은콩물 추출물이 인간 모유두 세포의 세포성장에 모발 성장 촉진 인자의 활성과 Erk의 활성화 등을 통한 기전으로 긍정적인 영향을 미침으로써 모발 성장 및 모발 건강을 위한 기능성 원료로서의 가능성을 확인할 수 있었으며, 유산균 2종(LGG, BB-12)을 이용한 발효검은콩이 검은콩과 비교하여 모발 성장 촉진 관련 단백질 발현에서는 유의적인 우월성을 가지지는 않음을 확인하였다. 추후 다른 유산균 균 총을 이용한 발효검은콩의 연구와 더불어 보다 정밀한 발효를 통한 검은콩 추출물의 성분과 조성의 변화를 바탕으로 한 모발 성장 및 모주기 관련 연구가 이루어져야 할 것이라 생각된다.
후속연구
- 지금까지 보고된 천연물 소재를 이용한 탈모치료 및 예방에 관련된 식품의 유용성 평가와 이들이 모발 성장에 미치는 효과에 관한 연구는 주로 동물모델을 이용하거나 동물에서 추출한 primary 모유두 세포를 이용하여 진행되었다. 동물 모델을 이용한 실험 결과를 통해 모발 건강 및 성장에 미치는 영향을 예측할 수 있으나 이러한 연구 결과를 토대로 한 인간 primary 모유두 세포를 이용한 추가적인 연구가 필요할 것이라 생각된다. 이에 본 연구에서는 검은콩 추출물과 프로바이오틱스 유산균 2종(LGG, BB-12)을 이용하여 발효시킨 발효검은콩이 인간 모유두 세포성장에 미치는 효과와 그 기전을 비교 분석함으로써 검은콩과 발효검은콩 추출물의 탈모 예방 및 치료를 위한 천연소재 모발건강 소재로써의 가능성을 살펴보고자 한다.
- 이는 Eom 등(35)에서 보고한 Bacillus natto 균과 Aspergillus oryzae 균을 각각 이용하여 발효시킨 발아콩 청국장과 혼합균주(Bacillus natto, Aspergillus oryzae)를 이용한 발아콩 청국장이 발효가 진행됨에 따라 총당과 환원당 함량이 모두 감소한다는 결과와 유사하며, Eom 등(35)은 총당과 환원당의 감소가 발효가 진행될수록 당화 amylase 작용에 의해 전분질을 당분으로 분해하고, 동시에 효모의 영양원이나 발효기질로 이용되기 때문이라 보고하였다. 이와 같은 현상이 본 연구조건에서도 적용되는지는 추가적인 연구가 필요하겠다.
- 따라서 검은콩 물 추출물과 검은콩 에탄올 추출물, 그리고 발효 검은콩물 추출물이 인간 모유두 세포의 세포성장에 모발 성장 촉진 인자의 활성과 Erk의 활성화 등을 통한 기전으로 긍정적인 영향을 미침으로써 모발 성장 및 모발 건강을 위한 기능성 원료로서의 가능성을 확인할 수 있었으며, 유산균 2종(LGG, BB-12)을 이용한 발효검은콩이 검은콩과 비교하여 모발 성장 촉진 관련 단백질 발현에서는 유의적인 우월성을 가지지는 않음을 확인하였다. 추후 다른 유산균 균 총을 이용한 발효검은콩의 연구와 더불어 보다 정밀한 발효를 통한 검은콩 추출물의 성분과 조성의 변화를 바탕으로 한 모발 성장 및 모주기 관련 연구가 이루어져야 할 것이라 생각된다.
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