선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 12)본 연구에서는 포공영 물추출물 투여 후 콜린성 신경계 차단 상태에서 ERK 단백질 발현의 변화를 확인하기 위해 western blot을 진행하였다. 그 결과 포공영 25, 50 mg/kg을 투여한 군은 scopolamine 투여군에 비해 ERK의 발현을 유의적으로 증가시켰다(F3,16=6.
- 본 연구에서는 포공영 물추출물을 이용하여 기억력 개선 효과를 콜린성 신경계 차단으로 인한 기억력 감퇴 마우스 모델에서 확인하고자 하였다. Y-미로 시험과 수동회피 시험을 통하여 기억력 개선 효과를 측정하였고, AChE 활성 검정을 통해 포공영의 AChE 억제 효능을 확인하였다.
- 연구에서는 포공영 물추출물이 scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴모델에서 기억력 개선효과를 나타내는지 확인하고자 하였다. 행동실험으로는 해마 의존성 인지기능 평가 방법인 Y-미로 시험 및 수동회피시험을 실시하였으며, 그 작용기전을 확인하기 위하여 포공영을 투여한 뒤 전체뇌 조직을 이용한 AChE 활성과 해마조직을 적출하여 western blot을 실시하였다.
제안 방법
- 13) 포공영(25, 50 mg/kg)과 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 경구 투여하고 30분 후에 scopolamine(1 mg/kg)을 복강 투여 한 다음 30분 후에 마우스를 치사시켜 뇌를 적출하고 전체 마우스 뇌를 10% 부피의 12.5 mM 인산 완충액(pH 7.0)을 가한 후 glass Teflon homogenizer(Eyela, Japan)에서 균질화하고 1000×g에서 10분간 4oC에서 원심 분리 하였으며, 분리된 상층액을 효소원으로 사용하였다.
- 양성 대조군에는 saline에 녹인 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 실험 1시간 전 경구 투여하였다. Scopolamine(1 mg/kg)은 saline에 녹여 대조군을 제외한 모든 군에 실험 30분 전에 복강 투여하였다. 수동회피시험은 검정색의 polyvinyl plastic으로 만든 바닥(20×20×20 cm)에 2 mm 간격의 grid가 깔린 밝은 방과 어두운 방의 두 개의 방으로 구성되어 있다.
- 양성 대조군에는 saline에 녹인 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 실험 1시간 전 경구 투여하였다. Scopolamine(1 mg/kg)은 saline에 녹여 대조군을 제외한 모든 군에 실험 30분 전에 복강 투여하였다. 수동회피시험은 검정색의 polyvinyl plastic으로 만든 바닥(20×20×20 cm)에 2 mm 간격의 grid가 깔린 밝은 방과 어두운 방의 두 개의 방으로 구성되어 있다.
- Western Blot Analysis − 포공영(25, 50 mg/kg)과 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 경구투여하고 30분 후에 scopolamine(1 mg/kg)을 복강 투여한 다음 30분 후에 마우스를 치사시켜 뇌를 적출하고 해마를 분리하였다.
- 본 연구에서는 포공영 물추출물을 이용하여 기억력 개선 효과를 콜린성 신경계 차단으로 인한 기억력 감퇴 마우스 모델에서 확인하고자 하였다. Y-미로 시험과 수동회피 시험을 통하여 기억력 개선 효과를 측정하였고, AChE 활성 검정을 통해 포공영의 AChE 억제 효능을 확인하였다. 그 결과 포공영 물추출물이 Y-미로 시험과 수동회피 시험에서 기억력 개선 효과를 보였으며, 이러한 효과가 포공영 물추출물이 포공영의 AChE 억제에 의한 것임을 확인하였다.
- Y-미로에서의 포공영 효과 − Scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴에 대한 포공영의 효과를 Y-미로 시험을 이용하여 확인하였다.
- Y-미로는 세 개의 가지로 구성되어 있는 검정색의 polyvinyl plastic으로 각 가지의 길이는 40 cm, 폭은 3 cm, 높이는 12 cm이고,세 가지가 접히는 각도는 120℃이다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 내려놓고 8분 동안 각 가지를 자유롭게 탐색할 수 있도록 한 다음, 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 3개의 다른 가지에 차례대로 들어가면 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하여 다음 공식으로 그 변경행동력을 계산하였다.
- 길로틴 문이 열린 후 60초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다. 길로틴 문이 열린 후 마우스가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴 문을 닫고 grid를 통해 0.
- 단백질의 정량은 Western blotting ECL kit(Amersham Co., England)를 사용하여 실시하였으며, 단백질(30 µg)을 SDS-polyacrylamide gel(8%)에 reducing condition에서 전기영동을 실시하였다.
- 길로틴 문이 열린 후 마우스가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴 문을 닫고 grid를 통해 0.5 mA의 전기 충격을 3초 동안 가하고, 24시간 후 다시 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 10초 간 탐색시간 후 길로틴 문을 열고 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 어두운 쪽으로 네발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency tim)을 300초까지 측정하여 포공영이 장기기억에 어떤 영향을 미치는지 평가하였다.
- 어두운 방은 grid를 따라 전기가 흐를 수 있도록 하였다. 마우스를 밝은 쪽 구획에 놓고 10초의 탐색시간 후 길로틴 문이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 길로틴 문이 열린 후 60초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다.
- 수동회피시험에서의 포공영 효과 − Scopolamine 투여에 의한 기억력 감퇴 동물 모델에서 포공영 투여에 의한 실험동물의 장기기억 개선효과를 확인하기 위하여 수동회피 시험을 실시하였다.
- 9% saline 수용액을 경구 투여하였다. 양성 대조군에는 saline에 녹인 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 실험 1시간 전 경구 투여하였다. Scopolamine(1 mg/kg)은 saline에 녹여 대조군을 제외한 모든 군에 실험 30분 전에 복강 투여하였다.
- 5 mA의 전기 충격을 3초 동안 가하고, 24시간 후 다시 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 10초 간 탐색시간 후 길로틴 문을 열고 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 어두운 쪽으로 네발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency tim)을 300초까지 측정하여 포공영이 장기기억에 어떤 영향을 미치는지 평가하였다.
- 배양시킨 membrane을 Trisbuffered saline/Tween 20으로 5회 세척 후 1:3000으로 희석한 2차 항체로 2시간 동안 incubation하였다. 이후 enhanced chemiluminescence (ECL)로 발광시켜 LAS-4000 mini bioimaging program(Fujifilm Lifescience USA, Stamford, CT, USA)을 이용하여 분석한 뒤 membrane을 20% glycine 용액으로 상온에서 20분 동안 stripping하였다. ERK 1차 항체를 이용한 실험도 상기와 같은 방법으로 실시하였다.
- 수동 회피 시험(Passive Avoidance Task) − 무작위로 마우스를 그룹으로 나누어 실험에 사용하였다. 포공영은 0.9% Saline 수용액에 녹인 후 실험 1시간 전 경구 투여(12.5, 25, 50, 100 mg/kg)하였으며, 대조군에는 투여군과 같은 용량의 0.9% saline 수용액을 경구 투여하였다. 양성 대조군에는 saline에 녹인 donepezil(DNZ, 5 mg/kg)을 실험 1시간 전 경구 투여하였다.
- 포공영의 AChE 활성 억제 작용 − 포공영의 AChE 활성에 미치는 영향을 확인하고자 ex-vivo 실험으로 AChE 활성을 측정하였다.
- 연구에서는 포공영 물추출물이 scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴모델에서 기억력 개선효과를 나타내는지 확인하고자 하였다. 행동실험으로는 해마 의존성 인지기능 평가 방법인 Y-미로 시험 및 수동회피시험을 실시하였으며, 그 작용기전을 확인하기 위하여 포공영을 투여한 뒤 전체뇌 조직을 이용한 AChE 활성과 해마조직을 적출하여 western blot을 실시하였다.
대상 데이터
- Y-미로 시험(Y-maze Task) − 약물 투여군은 무작위로 그룹을 나누어 실험에 사용하였다.
- 시험물질 − 실험에서 사용된 scopolamine과 donepezil은 Sigma Aldrich(St Louis, Mo, USA)의 제품을 사용하였으며, anti-phospho-extracellular singnal-regulate kinase(pERK)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)에서 구입하였다. anti-ERK는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, goat-anti-rabbit IgG는 Gene Tex Inc(San Antonio, Texas, USA)에서 구입하였으며, 그 외 다른 모든 시료는 시중에서 구할 수 있는 최상 등급의 제품을 사용하였다.
- 수동 회피 시험(Passive Avoidance Task) − 무작위로 마우스를 그룹으로 나누어 실험에 사용하였다.
- 시험물질 − 실험에서 사용된 scopolamine과 donepezil은 Sigma Aldrich(St Louis, Mo, USA)의 제품을 사용하였으며, anti-phospho-extracellular singnal-regulate kinase(pERK)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)에서 구입하였다.
- 실험동물 − 수컷의 ICR 마우스(5주령)를 주식회사 오리엔트(경기도, 대한민국)에서 공급받아 사용하였다.
- 실험동물은 경희대학교 약학대학 동물실에서 일주일간 적응시켰으며, 적응 기간 동안 동물실의 온도(23±3oC), 습도(60±10%) 및 명암주기(12시간)는 일정하게 유지하였다.
- 포공영 20 g을 분쇄하여 10배(v/w)의 증류수를 가한 후 환류 냉각기에서 100oC로 2시간 추출하였다. 추출완료 후, 추출액을 여과지(filter paper)로 여과하고, 감압증류장치를 이용하여 여액을 일정 부피가 될 때까지 농축하고, 동결 건조하여 포공영 물추출물(수득률: 18%)을 수득한 후 실험에 사용하였다.
- 포공영 추출물 제조 − 본 실험에서 사용한 포공영은 선일물산(서울, 한국)에서 구입하여 육창수 교수(경희대학교)로부터 감정을 받은 후 사용하였다.
데이터처리
- M으로 나타내었다. 모든 실험 결과는 일원분산분석(ANOVA)을 이용하여 통계처리하였고, 유의적인 차이가 있을 경우 Student-NewmanKeuls방법을 이용하여 95% 신뢰 수준 이하에서 군간 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- AChE 활성 분석 − AChE 활성 검정은 acetylthiocholine iodide 기질을 기반으로 비색측정 방법을 이용한 Ellman의방법에 의거하여 수행하였다.
성능/효과
- 14) Scopolamine에 의해 증가된 AChE의 활성이 포공영 물추출물(25, 50 mg/kg)의 투여로 현저히 감소되었으며, donepezil의 투여 군에서도 감소의 정도가 거의 동일하였다(p<0.05).
- ), 서양 민들레(Taraxacum officinale Weber), 털 민들레(Taraxacum ongolicum Handel-Mazzetti), 흰민들레(Taraxacum coreanum Nakia)의 전초를 말린 것이다.8) 포공영은 강한 생존력을 지니고 있어 도로변 및 척박한 토양 환경 등에서 서식이 가능하고 아시아, 유럽 및 미국 등 북반부를 중심으로 온대지역에서부터 한대지역에 걸쳐 광범위하게 분포하고 있다. 전통적으로 포공영은 청열해독(淸熱解毒), 소종산결(消腫散結), 이뇨통림(利尿通淋) 등의 작용을 가지고 있으며 유옹(乳癰) 의 치료에 이용되어 왔다.
- Scopolamine 투여로 인해 변경 행동력(spontaneous alterations, %)이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(p<0.05), 이는 scopolamine을 이용한 기억력저해 모델이 잘 작성되었음을 의미한다.
- Scopolamine의 투여로 인하여 머무름 시간(latency time)이 대조군에 비해 유의적으로 감소함을 확인하여(p<0.05), 기억력 저하 동물모델이 잘 작성되었음을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 포공영 25, 50 mg/kg을 투여한 군은 scopolamine 투여군에 비해 ERK의 발현을 유의적으로 증가시켰다(F3,16=6.106, p<0.05, Fig. 4).
- Y-미로 시험과 수동회피 시험을 통하여 기억력 개선 효과를 측정하였고, AChE 활성 검정을 통해 포공영의 AChE 억제 효능을 확인하였다. 그 결과 포공영 물추출물이 Y-미로 시험과 수동회피 시험에서 기억력 개선 효과를 보였으며, 이러한 효과가 포공영 물추출물이 포공영의 AChE 억제에 의한 것임을 확인하였다. 그러나 포공영 추출물은 고용량에서 효과가 감소되는 경향을 보여 전형적인 S자형의 용량-의존 관계가 아닌 inverted-U형의 용량-의존 관계를 보였다.
- 그 결과 포공영 물추출물이 Y-미로 시험과 수동회피 시험에서 기억력 개선 효과를 보였으며, 이러한 효과가 포공영 물추출물이 포공영의 AChE 억제에 의한 것임을 확인하였다. 그러나 포공영 추출물은 고용량에서 효과가 감소되는 경향을 보여 전형적인 S자형의 용량-의존 관계가 아닌 inverted-U형의 용량-의존 관계를 보였다. 이러한 용량-의존 관계는 AChE 억제제에서 독특하게 관찰되는 현상으로 아세틸콜린의 과다 분비에 의한 시냅스 전 수용체를 통한 신경전달 물질의 과다분비 억제가 하나의 원인이라고 알려져 있다.
- 일원분산분석 결과 각 투여군에서 AChE 활성이 유의적으로 변화 되었음을 확인할 수 있었다(F4,20=21.29, p<0.05, Fig. 3).
- 일원분산분석 결과 각 투여군에서 변경 행동력의 유의적인 변화가 관찰되었다(F6,58=7.105, p<0.05, Fig. 2A).
- 일원분산분석 결과 각 투여군에서 유의적인 결과를 나타내었다(F6,57=22.35, p<0.05, Fig. 1).
후속연구
- 본 연구 결과를 토대로 포공영 물추출물이 콜린성 신경계 기능 저하에 의한 인지기능 손상에 대해 회복 효과를 가질 것으로 생각되며, 포공영이 식용가능한 원료임을 감안할 때 향후 인지기능과 관련된 건강기능식품으로의 개발이 기대된다. 또한, 성분연구를 통해 AChE 억제 활성을 갖는 물질이 확보된다면 리드화합물로서의 가치도 가질 수 있을 것이다.
- 16) 그러나 수동회피실험에서 나타난 inverted-U 형의 용량-의존관계를 설명할 정확한 기전은 불분명하다. 본 연구 결과를 토대로 포공영 물추출물이 콜린성 신경계 기능 저하에 의한 인지기능 손상에 대해 회복 효과를 가질 것으로 생각되며, 포공영이 식용가능한 원료임을 감안할 때 향후 인지기능과 관련된 건강기능식품으로의 개발이 기대된다. 또한, 성분연구를 통해 AChE 억제 활성을 갖는 물질이 확보된다면 리드화합물로서의 가치도 가질 수 있을 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.