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문제 정의
- 본 연구에서는 19종의 약용식물에 대하여 C. albicans에 대한 항균력을 검토하였으며, 그 중 지유 추출물의 C. albicans에 대한 억제력과 지유 추출물 용매분획의 항균활성을 확인하여 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- HPLC system은 Waters 2796 Bioseparations Module과 Phenomenex Gemini-nx (250× 4.6 mm, 5u) C-18 column, Waters 2996 Photodiode Array Detector를 사용하였으며, 이동상으로는 3DW(A)과 Acetonitrile(B)의 농도구배법(0-5 min(80(A):20(B),5-30 min(50(A):50(B))으로 1 mL/min의 유속으로 분석을 실시하였다.
- 즉 0.45 μm membrane filter로 제균한 추출물들을 40 μg부터 320 μg까지 단계별로 평판 배지위에 접종하여 24oC에서 24 h, 48 h 배양한 후 육안으로 관찰했을 때 C.albicans 억제환이 나타나기 시작한 농도를 MIC 농도로 결정하였다.
- 지름 8 mm paper disc에 시료를 100 μl(400 mg/ml, 40 mg)를 흡수시킨 후 평판배지위에 고정하고 24oC에서 24 h, 48 h 배양하여 disc 주위에 나타난 억제환의 직경의 크기로 항균성을 평가하였다.
- 지유 CHCl3 분획의 HPLC분석 - 실험에서 유의한 활성을 나타낸 CHCl3 분획에서 활성화합물 추적을 위하여 분석용 HPLC를 실시하였다.
- 지유의 에탄올엑스 50 g을 증류수에 현탁 시키고 상법에 따라 동량의 용매를 n-hexan(0.6 g), chloroform(0.5 g), ethyl acetate(5.6 g), n-butanol(11.5 g) 순으로 가하여 용매 분획한 후 감압 농축하여 각각의 분획물의 엑스를 얻었다.
- 추출 및 분획 - 각 재료 600 g을 정확히 칭량한 후 분쇄 하여 각 재료의 10배에 해당하는 100% 에탄올을 가한 후 40oC의 수조에서 48시간 진탕 후 여과하고 감압 농축하여 시료로 사용하였다.
- 희석된 각각의 균액 200 μl씩을 YM 평판배지에 균일하게 도말하여 24 h 시간 배양 후 Paper disc diffusion법에 적절한 균의 농도를 평가 하여 10-5농도로 결정하였다.
대상 데이터
- 6 mm, 5u) C-18 column, Waters 2996 Photodiode Array Detector를 사용하였으며, 이동상으로는 3DW(A)과 Acetonitrile(B)의 농도구배법(0-5 min(80(A):20(B),5-30 min(50(A):50(B))으로 1 mL/min의 유속으로 분석을 실시하였다. 검출기는 190-500 nm(1.2 nm 해상도)로 분석하여 그 중 주요 화합물의 peak검출이 용이한 254 nm에서 전체 chromatogram을 추출하여 자료로 활용하였다.
- 세균배양12) - C. albicans (ATCC 18804, KCCM 50235) 는 Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM)에서 동결 건조된 균을 구입하여 yeast malt 배지(YM, containing Yeast extract, Malt extract, Peptone, Dextrose, Agar)에 접종하여 24oC에서 24 h 5회 계대 배양한 후 사용하였다.
- 실험재료 - 실험에 사용된 지유 및 기타 한약재는 세화당 한약도매상(광주광역시)에서 규격품을 구입하였으며, 이재혁교수가 정밀하게 감정 후 사용하였다.
이론/모형
- 최소저해농도 측정(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)14) - MIC는 Paper disc diffusion법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 48시간 배양 시 40 μg/50 μl, 80 μg/50 μl, 160 μg/50 μl에서는 전혀 억제 작용이 없었으며 240 μg/50 μl에서 억제작용이 나타나기 시작했으며 320 μg/50 μl에서는 12.3 mm를 나타내었다.
- 또한 지유의 chloroform 분획은 48시간 배양에도 비교적 그 억제력이 저하되지 않음은 매우 의미 있게 관찰되었다. C. albicans에 대한 억제력을 24시간, 48시간 지속적으로 관찰하면서 C. albicans의 생장 속도에 따른 억제력 및 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과 항칸디다 천연소재로의 가능성을 보였다. 지유 CHCl3 분획의 HPLC분석에서 peak A와 peak B를 확인할 수 있었으며 이들 물질의 분리와 화학 구조 동정을 진행 중에 있으며, 차후 단일 물질수준에서 C.
- 억제환의 지름은 각각 17 mm, 16 mm를 나타냈으며, Cinnamomum cassia는 21 mm, 15 mm, Rheum coreanum NaKai는 24시간에서는 12 mm를 나타냈으나, 48시간에서는 억제를 나타내지 못했다. Perilla frutescens는 12 mm, 9 mm를 나타냈으며, Eugenia caryophyllata 19 mm, 17 mm, Melaphis chinensissms 25 mm, 21 mm, Prunus mume, 13 mm, 13 mm, 양성대조군으로 사용한 fluconazol(50 mg/ml, 5 mg)은 14 mm, 10 mm를 나타내었으며 시료를 용해한 용매인 50% 에탄올은 억제력이 없었다(Table I, Fig. 1).
- 금번 연구에서 지유의 n-hexan, chloroform 분획에서의 C.albicans에 대한 억제력을 확인하였으며 그 억제력이 매우 우수하였다.
- 또한 chloroform 분획의 MIC 농도는 24 시간에서 80 μg/50 μl 및 48 시간에서 240 μg/50 μl이었다. 또한 chloroform 분획의 HPLC 분석 결과 peak A, peak B를 확인할 수 있었다. 이는 C.
- 약용식물 19종의 C. albicans에 대한 항진균 효과를 연구한 결과 Sanguisorba officinalis L., Cinnamomum cassia, Rheum coreanum, Perilla frutescens 및 Eugenia caryophyllata가 C. albicans 억제효과를 나타냈다. 이중에서 Sanguisorba officinalis L.
- 즉 24시간 C. albicans 배양 시 paper disk diffusion법에 의한 지유의 chloroform 분획의 MIC 농도는 약 80 μg/50 μl으로 나타났으며 48시간 배양 시는 240 μg/50 μl으로 나타났다 (Table III, Fig. 3).
- 지유 Chloroform 분획의 C. albicans에 대한 최소저해 농도(MIC) - 지유의 chloroform 분획의 MIC 농도를 측정한 결과 24시간 배양 시 40 μg/50 μl에서는 전혀 억제 작용이 없었으며 80 μg/50 μl에서 억제작용이 나타나기 시작했다 (10.5 mm).
- 지유 분획의 C. albicans에 대한 항균효과 - 지유 분획의 C. albicans에 대한 항균력 실험 결과 n-hexan층의 24 h, 48 h 저해력은 25 mm, 14 mm를 나타냈으며, chloroform층은 28 mm, 18 mm로 가장 우수한 저항력을 나타내었다.
- 의 항균활성이 우수했으며 48시간 배양까지 그 항균력이 지속되었다. 지유의 에탄올 추출물을 용매분획 하여 항균성을 검토한 결과 n-hexan, chloroform 분획의 항균작용이 우수했으며 48시간 배양 시 chloroform 분획의 항균작용이 가장 우수하였다. 또한 chloroform 분획의 MIC 농도는 24 시간에서 80 μg/50 μl 및 48 시간에서 240 μg/50 μl이었다.
후속연구
- albicans 억제에 유효한 활성화합물 추적을 위하여 분석용 HPLC를 실시한 결과 peak A, peak B를 확인할 수 있었으며 현재 column chromatography, Prep. HPLC 등을 활용하여 분리를 하고 있으며 향후 NMR 분석 등을 통해 그 화학 구조를 동정할 계획이다(Fig. 4, 5).
- albicans의 생장 속도에 따른 억제력 및 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과 항칸디다 천연소재로의 가능성을 보였다. 지유 CHCl3 분획의 HPLC분석에서 peak A와 peak B를 확인할 수 있었으며 이들 물질의 분리와 화학 구조 동정을 진행 중에 있으며, 차후 단일 물질수준에서 C. albicans에 대한 심도 있는 연구진행이 필요할 것으로 사료된다.
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