레조시놀다이펜틸에터(1,3-di(pentyloxyl)benzene)의 피부 미백 효과를 확인하기 위해 in vitro 실험을 통하여 미백 효과를 평가하였다. 레조시놀다이펜틸에터는 resorcinol과 1-bromopentane의 알킬화반응을 통하여 제조하였으며, 반응 결과물을 NMR, MS 등의 분석장비를 통해 확인하였다. 레조시놀다이펜틸에터의 피부 안전성 평가를 위하여, 피부를 구성하는 세포들(keratinocyte, melanocyte, fibroblast)에 대한 독성을 분석한 결과 대조군에 비해서 모든 세포주들에서 유사한 cell viability를 확인하였다. 세포생존에 영향을 미치지 않는 농도인 $20{\mu}g/mL$에서 세포 외 멜라닌 분비 저해능을 측정한 결과 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 약 65.75%까지 농도 의존적으로 멜라닌 분비를 억제하는 것을 확인하였으며, 세포 내 멜라닌 생성 억제율을 측정한 결과에서도 약 53.89%를 억제함을 확인하였다. 멜라닌 형성 관련 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 real-time PCR 방법과 western blot으로 측정을 한 결과 레조시놀다이펜틸에터는 멜라닌 억제효과가 전사(transcription)단계부터 억제하는 것을 확인하였다. 최종적으로 본 연구는 레조시놀다이펜틸에터의 미백기능성화장품 신소재로서의 적용가능성을 제시하였다.
레조시놀다이펜틸에터(1,3-di(pentyloxyl)benzene)의 피부 미백 효과를 확인하기 위해 in vitro 실험을 통하여 미백 효과를 평가하였다. 레조시놀다이펜틸에터는 resorcinol과 1-bromopentane의 알킬화반응을 통하여 제조하였으며, 반응 결과물을 NMR, MS 등의 분석장비를 통해 확인하였다. 레조시놀다이펜틸에터의 피부 안전성 평가를 위하여, 피부를 구성하는 세포들(keratinocyte, melanocyte, fibroblast)에 대한 독성을 분석한 결과 대조군에 비해서 모든 세포주들에서 유사한 cell viability를 확인하였다. 세포생존에 영향을 미치지 않는 농도인 $20{\mu}g/mL$에서 세포 외 멜라닌 분비 저해능을 측정한 결과 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 약 65.75%까지 농도 의존적으로 멜라닌 분비를 억제하는 것을 확인하였으며, 세포 내 멜라닌 생성 억제율을 측정한 결과에서도 약 53.89%를 억제함을 확인하였다. 멜라닌 형성 관련 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 real-time PCR 방법과 western blot으로 측정을 한 결과 레조시놀다이펜틸에터는 멜라닌 억제효과가 전사(transcription)단계부터 억제하는 것을 확인하였다. 최종적으로 본 연구는 레조시놀다이펜틸에터의 미백기능성화장품 신소재로서의 적용가능성을 제시하였다.
The objective of this study was to investigate skin whitening effect of Resorcinol dipentyl ether [1,3-di(pentyloxyl)benzene] by in vitro experiments. Resorcinol dipentyl ether was prepared by alkylation of resorcinol with 1-bromopentane. The reaction products were confirmed by NMR, MS and other ana...
The objective of this study was to investigate skin whitening effect of Resorcinol dipentyl ether [1,3-di(pentyloxyl)benzene] by in vitro experiments. Resorcinol dipentyl ether was prepared by alkylation of resorcinol with 1-bromopentane. The reaction products were confirmed by NMR, MS and other analytical equipments. In order to evaluate the skin safety of resorcinol dipentyl ether, the cytotoxicity of the cells constituting the skin (keratinocyte, melanocyte, fibroblast) was analyzed and similar cell viability was observed in all cell lines as compared with the control group. Inhibition of extracellular melanin synthesis effect of resorcinol dipentyl ether was approximately 65.75% at $20{\mu}g/mL$ and inhibition of intracellular melanin synthesis effect of resorcinol dipentyl ether was approximately 53.89% at $20{\mu}g/mL$. The real-time PCR and western blot analysis of mRNA expression and protein expression of tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 related to melanogenesis revealed that melanin inhibitory effect of resorcinol dipentyl ether was inhibited from the transcription stage respectively. Finally, this study suggested applicability of Resorcinol dipentyl ether [1,3-di(pentyloxyl)benzene] as a whitening functional cosmetic new material.
The objective of this study was to investigate skin whitening effect of Resorcinol dipentyl ether [1,3-di(pentyloxyl)benzene] by in vitro experiments. Resorcinol dipentyl ether was prepared by alkylation of resorcinol with 1-bromopentane. The reaction products were confirmed by NMR, MS and other analytical equipments. In order to evaluate the skin safety of resorcinol dipentyl ether, the cytotoxicity of the cells constituting the skin (keratinocyte, melanocyte, fibroblast) was analyzed and similar cell viability was observed in all cell lines as compared with the control group. Inhibition of extracellular melanin synthesis effect of resorcinol dipentyl ether was approximately 65.75% at $20{\mu}g/mL$ and inhibition of intracellular melanin synthesis effect of resorcinol dipentyl ether was approximately 53.89% at $20{\mu}g/mL$. The real-time PCR and western blot analysis of mRNA expression and protein expression of tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 related to melanogenesis revealed that melanin inhibitory effect of resorcinol dipentyl ether was inhibited from the transcription stage respectively. Finally, this study suggested applicability of Resorcinol dipentyl ether [1,3-di(pentyloxyl)benzene] as a whitening functional cosmetic new material.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 속수자(Euphorbia Lathyris)의구성물질인 sucrose 3,4,6,2',6-pentaisovalerate (SPI)의 구조/활성 상관성 분석(structure/activity relationship analysis)을 수행하여 개발된 피부 미백제 레조시놀다이펜틸에터의 피부 안전성을 평가하고, in vitro 실험을 통한 미백 효과를 평가하였다.
제안 방법
감압 농축하여 수득한 crude 1,3-di(pentyloxy)benzene을 고온 감압의 조건에서 증류, 정제하였다. 1차 증류하여 수득한 증류오일을 동일한 조건에서 2차 증류하여 99.5%의 고순도 1,3-di(pentyloxy)benzene (Figure 1)를 수득하였다.
Antibody는 β-actin sc-47778 (Santa Cruz, USA)을 1 : 2,000으로희석하여 사용하였고, tyrosinase sc-7833 (Santa Cruz),TRP-1 sc-10443 (Santa Cruz), TRP-2 sc25544 (Santa Cruz)는 1 : 500으로 희석하여 사용하였다. ChemiDoc을 이용하여 이미지를 획득하였고 image lab software를 이용하여 단백질 발현량을 분석하였다.
Maxime RT PreMix kit random primer (iNtRON biotechnology, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 45 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min을 수행하였다.
KG, Germany)를 사용하여 RNA를 추출하였다. TakeTM micro-volum plate(Yeastern biotech, Taiwan)를 사용하여 RNA를 정량하였다.
iQTM SYBR green supermix (Bio-Rad, Singapore)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였으며, 조건은 polymerase activation과 DNA denaturation 95 ℃에서 3 min 진행한 후,amplification은 94 ℃에서 15 s 동안 denaturation, annealing 58 ℃ 30 s, extension 72 ℃ 1 min으로 35 cycle 하였고, melt curve는 65 ℃에서 95 ℃를 수행하였다.
유기층을 분리하여 MgSO4로 수분을 제거하고 감압하여 농축한다. 감압 농축하여 수득한 crude 1,3-di(pentyloxy)benzene을 고온 감압의 조건에서 증류, 정제하였다. 1차 증류하여 수득한 증류오일을 동일한 조건에서 2차 증류하여 99.
고자장 영역에서는 6개의 methylene protonδH 1.75 (4H, m), 1.38 (8H, m) signal과 2개의 methyl proton δH 0.90 (6H, t, J=7.6 Hz) signal을 관측하였으며, signal의 적분 값으로부터 각 signal이 벤젠고리에 대칭으로 존재함을 확인하였다(Figure 2).
레조시놀다이펜틸에터의 안전성을 평가를 위하여,피부를 구성하는 keratinocyte, melanocyte, fibroblast 세포들에 대한 독성을 분석하였다. 독성 분석은 각 세포주들의 미백제에 대한 생존력(cell viability)을 조사하여 평가하였다. 피부를 구성하는 각각의 세포주들을 CO2 배양기에서 각각 6-well cell culture plate에 1 × 105 cells/well 농도로 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배양액으로 24 h 배양한 후 레조시놀다이펜틸에터를 농도별(5-20 µg/mL)로 48 h 동안 처리한 후 MTT assay를 통해서 세포 생존률을 분석하였다.
레조시놀다이펜틸에터의 세포 생존에 영향을 미치지 않는 20 µg/mL 이하 농도로 세포 내⋅외 멜라닌 측정을 수행하였다.
레조시놀다이펜틸에터의 안전성을 평가를 위하여,피부를 구성하는 keratinocyte, melanocyte, fibroblast 세포들에 대한 독성을 분석하였다. 독성 분석은 각 세포주들의 미백제에 대한 생존력(cell viability)을 조사하여 평가하였다.
멜라닌 형성 관련 단백질인 티로시나제 단백질 발현량을 측정하였고 0.62, 1.25 µg/mL 농도에서 티로시나제 발현이 억제되는 것을 확인하였다(Figure 12).
세포독성 및 멜라닌 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16F10 melanoma (ATCC® CRL 6475TM), keratinocyte HaCaT (CLS 300493), fibroblast CCD986SK(ATCC® CRL 1947TM)와 세포 배양을 위해 Dulbecco’sModified Eagle’s Medium (high glucose DMEM, ThermoFisher, USA), penicillin/streptomycin solution (SV30010,Thermo Fisher), fetal bovine serum (SH30406.02, ThermoFisher), trypsin-EDTA (10x 15400-054, Thermo Fisher),6-well cell culture plate (3335, Corning, USA), 96-well cell culture plate (3595, Corning), 100 mm cell culture dish (172958, Thermo Fisher), EZ-CYTOX (EZ-1000,Daeillab, Korea)를 사용하였다.
세포에 시료 처리 시 각각의 시료 농도에 대한 solvent로 사용한 DMSO 양이 다르기 때문에 시료농도 5,10, 20 µg/mL에 대한 각각의 대조군을 설정하였다.
수득한 반응물을 NMR spectrometer과 MS spectrometer 등을 통해 구조를 확인하였다. 1H-NMR (400MHz, CDCl3, δH) 스펙트럼의 저자장 영역에서 4개의olefine methine proton δH 7.
수득한 세포를DPBS로 세척하고 원심분리하여 상층액을 제거하고 cell pellet을 얻었으며, Nucleospin RNA (740955,Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
30 µg의 단백질을 Nupage LDS sample buffer를 첨가하여 5 min 간 100 ℃에서 중탕하고 반응이 끝난 후 얼음에 방치하여 시료를 준비하였으며 NuPAGE SDS-PAGEgel system (Invitrogen)을 이용하여 100 V에서 전기영동을 하였다. 전기영동이 완료된 후 gel transfer device(Invitrogen)를 이용하여 bloting을 실시하였다. Antibody는 β-actin sc-47778 (Santa Cruz, USA)을 1 : 2,000으로희석하여 사용하였고, tyrosinase sc-7833 (Santa Cruz),TRP-1 sc-10443 (Santa Cruz), TRP-2 sc25544 (Santa Cruz)는 1 : 500으로 희석하여 사용하였다.
피부를 구성하는 각각의 세포주들을 CO2 배양기에서 각각 6-well cell culture plate에 1 × 105 cells/well 농도로 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배양액으로 24 h 배양한 후 레조시놀다이펜틸에터를 농도별(5-20 µg/mL)로 48 h 동안 처리한 후 MTT assay를 통해서 세포 생존률을 분석하였다.
대상 데이터
레조시놀다이펜틸에터의 합성에 사용된 resorcinol은 Junsei EP grade을 사용하였으며, 1-bromopatane은 TCI의 제품을 정제 없이 그대로 사용하였다. Potassium phosphate tribasic, potassium iodide와 sodium chloride,magnesium sulfate anhydrous, ethyl acetate는 Daejung chemicals & metals Co.
제품을 정제 없이 사용하였다. 물은 순수제조장치(RiOsTM 5, Millipore, USA)에의해 제조된 정제수를 사용하였다.
본 실험에 사용된 세포주인 B16F10 melanoma, keratinocyte, fibroblast를 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM으로 세포수가 5 × 105 cells/dish가 되도록 배양한다.
Ltd. 제품을 정제 없이 사용하였다. 물은 순수제조장치(RiOsTM 5, Millipore, USA)에의해 제조된 정제수를 사용하였다.
TRP-2 단백질 발현량을 측정한 결과에서도 2.5, 5, 10 µg/mL 농도에서 억제되는 것을 확인하였다(Figure 14).
또한 세포 외 멜라닌 분비 저해능을 측정한 결과에서 20 µg/mL 농도로 처리하였을 때 약 65.75% 억제하였으며.
또한 시료처리 후 48 h 후의 mRNA 발현 결과에서도 농도 의존적인 억제 결과는 얻지 못하였으나, 티로시나제, TRP-1, TRP-2 유전자 모두 0.31, 5µg/mL 농도에서 mRNA 발현이 억제함을 확인하였다(Figure 7, 9, 11).
또한,TRP-1 단백질 발현량을 측정한 결과에서도 0.62, 1.25,10 µg/mL 농도에서 TRP-1 발현이 억제되는 것을 확인하였다(Figure 13).
레조시놀다이펜틸에터는 레조시놀(resorcinol)과1-bromopentane의 알킬화반응을 통하여 제조되어지며,피부를 구성하는 세포들에 대한 독성을 분석한 결과대조군에 비해서 모든 세포주들에서 유사한 cell viability를 보여주었으며, 레조시놀다이펜틸에터에 대한 세포 독성이 거의 나타나지 않는 것으로 관찰되었다.
레조시놀다이펜틸에터를 농도별로 5-20 µg/mL 처리한 후 48 h 동안 관찰한 결과 대조군에 비해서 모든 세포주들에서 유사한 cell viability를 보여주었다.
멜라닌 억제 효과가 전사(transcription)단계부터 억제되는지 확인하기 위해서 멜라닌 형성 관련 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 western blot으로 측정한 결과농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 억제시켰던 결과와 달리 멜라닌 형성 관련 mRNA과 단백질 발현량을 농도 의존적으로 억제시키지 못하였으나, 영향은 있는 것으로 분석되며, TRP-2 단백질 발현 억제로 인한 영향이 멜라닌 억제효과에 컸던 것으로 사료된다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 레조시놀다이펜틸에터는 색소침착 방지 개선효과에서 기능성 미백화장품 소재로서의 활용가능성이 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 억제시켰던 결과와 달리 멜라닌 형성 관련 mRNA과 단백질 발현량을 농도 의존적으로억제시키지 못하였으나, 영향은 있는 것으로 분석되며 시료의 약물동태특성상 steady state가 발생됨이 확인하였다[16]. 본 실험에서 1차 반응을 거쳐 0차 반응이 시험농도 범위에서 나타남을 확인하였다.
75% 억제하였으며. 세포 내 멜라닌 생성 억제율을 측정한 결과에서도 약 53.89%를 억제함을 확인하였다.
세포 외 멜라닌 분비 저해능을 측정한 결과 20 µg/mL 농도에서 약 65.75%까지 농도 의존적으로 멜라닌 분비를 저해시켰으며, 세포 내 멜라닌생성 억제율을 측정한 결과 20 µg/mL 농도에서 약 53.89%까지 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하였다(Table 5, 6 and Figure 4, 5).
시료처리 후 24 h 후의 멜라닌 형성 관련 mRNA 발현량을 측정한 결과에서 티로시나제의 경우 발현량을억제시키지 못하였고(Figure 6), TRP-1, TRP-2의 경우 농도 의존적으로 억제시키지 못하였으나, 0.31, 0.62,1.25, 2.5 µg/mL 농도에서 발현이 억제함을 확인하였다(Figure 8, 10).
이러한 결과는 각각의 농도에 대한 대조군과 비교시 DMSO에 대한 독성이 나타날 뿐 레조시놀다이펜틸에터에 대한 독성은 없는 것으로 확인하였다(Table 2-4).
5, 5, 10 µg/mL 농도에서 억제되는 것을 확인하였다(Figure 14). 이상의 결과에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 억제시켰던 결과와 달리 멜라닌 형성 관련 mRNA과 단백질 발현량을 농도 의존적으로억제시키지 못하였으나, 영향은 있는 것으로 분석되며 시료의 약물동태특성상 steady state가 발생됨이 확인하였다[16]. 본 실험에서 1차 반응을 거쳐 0차 반응이 시험농도 범위에서 나타남을 확인하였다.
후속연구
멜라닌 억제 효과가 전사(transcription)단계부터 억제되는지 확인하기 위해서 멜라닌 형성 관련 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 western blot으로 측정한 결과농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 억제시켰던 결과와 달리 멜라닌 형성 관련 mRNA과 단백질 발현량을 농도 의존적으로 억제시키지 못하였으나, 영향은 있는 것으로 분석되며, TRP-2 단백질 발현 억제로 인한 영향이 멜라닌 억제효과에 컸던 것으로 사료된다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 레조시놀다이펜틸에터는 색소침착 방지 개선효과에서 기능성 미백화장품 소재로서의 활용가능성이 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
사람의 피부색을 결정하는 요인은 무엇인가?
사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데 이 중 멜라닌이 가장 결정적인 요소이다. 멜라닌은 피부 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질세포(keratinocyte)로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다[1].
멜라닌의 과잉 생산은 피부에 어떤 영향을 주는가?
멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증(vitiligo)과 같은 피부 병변이 유발된다. 반대로 과잉 생산은 중년 여성들의 주요 고민 중 하나인 기미,주근깨를 형성하며 또한 피부색과도 밀접한 관계가 있다[2].
각질세포에 멜라닌이 생기는 과정은 어떠한가?
미백 작용을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질 세포로 전이된다[3-5]. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 도파크롬토토머라제(dopachrome tautomerase)가 있다.
참고문헌 (16)
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