B16 melanoma세포에서 배양 시 시료 처리에 의한 멜라닌 생성의 억제 정도를 측정하는 방법으로 B16 melanoma세포에 알부틴, 유용성감초추출물, 혼합물을 처리하고 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 관찰하였다.

대부분의 티로시나아제는 L-DOPA를 기질로 활용하여 melanin을 생성하는 속도 가 더 빠르다고 알려져 있다.[13] 기질인 L-tyrosine과mushroom tyrosinase 그리고 시료를 함께 반응시킨 후 티로신으로부터 생성된 도파크롬의 opticaldensity (이하 O.D)값을 측정한다. O.

멜라닌 생성과정 중 DOPA에서 DOPA quinone으로 전환될 때 참여하는 tyrosinase 활성억제 정도를 cell lysate를 이용해 측정하는 방법으로 실험법은 다음과 같다. B16 세포를 배양용 60mm dish (TPP, Switzerland)를 사용하여 각 well당 5X10⁴개 씩 분주한다.

혼합물은 유용성감초추출물의 세포독성으로 세포독성이 전혀 나타나지 않은 20㎕/㎖을 고정시키고 알부틴을 20㎕/㎖ (1:1), 30㎕/㎖ (1:1.5),40㎕/㎖ (1:2), 50㎕/㎖ (1:2.5), 100㎕/㎖(1:5)의 비율로 증량하여 실험하였다. 모든 혼합물에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

혼합물은 유용성감초추출물의 세포독성으로 세포독성이 전혀 나타나지 않은 20㎕/㎖을 고정시키고 알부틴을 20㎕/㎖ (1:1), 30㎕/㎖ (1:1.5),40㎕/㎖ (1:2), 50㎕/㎖ (1:2.5), 100㎕/㎖(1:5)의 비율로 증량하여 실험하였다. 모든 혼합물에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

B16 mouse melanoma cell 은 한국세포주은행(The Korean Cell Bank)에서 구입하여 사용하였다.

B16 mouse melanoma 세포(이하 ‘B16 세포’로 표기)는 10% fetal bovine serum(FBS), 100U/mL페니실린(penicillin), 100μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지에서 배양온도 37℃와 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다.

Mushroom tyrosinase, L-Tyrosin (Sigma, USA), Dulbecco's modifide Eagle's medium(DMEM), antibiotic-antimycotic solution(100X), trypsin-EDTA (10X), fetal bovine serum (FBS) 및 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)는 WelGENE Inc. (Daegu, Korea)에서 구입하였다.

본 연구는 미백활성이 있는 것으로 알려진 물질 중 대중적으로 많이 사용되고 있는 알부틴과 유용성감초추출물의 혼합물로 시험을 진행하였다. 혼합물은 유용성감초추출물의 세포독성으로 세포독성이 전혀 나타나지 않은 20㎕/㎖을 고정시키고 알부틴을 20㎕/㎖ (1:1), 30㎕/㎖ (1:1.

본 연구에서는 미백활성이 있는 것으로 알려진 물질 중 대중적으로 많이 사용되고 있는 알부틴과 유용성감초추출물의 혼합물로 시험을 진행하였다. 이 외에도 미백활성이 있는 물질이 다수 존재하기에 이 실험만으로 미백활성 물질을 혼합하여 사용함에 의해 모든 물질이 미백활성이 증가되는 것은 아니라고 생각한다.

96well plate (Nunc, USA), Pipet (Gilson, USA), white tip (Axygen Scientific, Inc, CA), yellow tip (Axygen Scientific, Inc, CA), blue tip(Axygen Scientific, Inc, CA), 1N NaOH (sigma) 및 3,4-dihydroxyphenylalanine (sigma) 에서 구입하였다. 알부틴은 Bioland (Korea), 유용성 감초 추출물은 Maruzen (Japan)에서 구입하였다.

모든 자료는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고, 차이의 유의성은 student's t-test를 이용하여 검증하였다.

세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포독성 확인 실험인 MTT assay를 수행하였다. 알부틴과 유용성감초추출물은 이미 고시 원료로 안전성이 입증된 원료이긴 하지만 혼합물의 경우 혼합비에 따라 어떠한 양상을 보이는지 확인하였다.

세포의 생존율을 알아보기 위해서 세포독성 확인 실험[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay]을 실행하였다. Cell은 well당 5×10³개로 counting하여 96 well plate에 접종하고 24시간 배양하였고 이후 배지를 제거하고, 농도별로 처리된 배지로 교체하여 3일 배양한 다음 배지를 제거하고D-PBS로 세척하였다.

1. 알부틴은 0~1000㎕/㎖ 의 농도에서 세포독성을 확인한 결과 control 대비 1000㎕/㎖에서 약간의 세포 독성이 나타남을 확인하였으며, 유용성감초추출물은 100㎕/㎖의 농도에서 세포 독성을 보였다. 혼합물에서는 세포독성이 나타나지 않았다.

1:1, 1:1.5, 1;2, 1:2.5, 1:5의 비율로 혼합한 혼합물의 mushroom tyrosinase 활성 억제율은 각각 87%, 91%, 93%, 94%로 나타나 활성 억제효과가 각 소재의 단독 사용 대비 매우 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다.(Fig.

1:1, 1:1.5, 1;2, 1:2.5, 1:5의 비율의 혼합물의 멜라닌 생성 억제율은 각각 52%, 55%, 58%, 56%, 54%로 나타났다. 이 결과로 보았을 때 혼합물의 경우 알부틴, 유용성감초추출물을 단독 사용 시 보다는 그 효능 효과가 좋아지긴 했으나 알부틴의 농도가 증가하여도 멜라닌 생성 억제력은 tyrosinase 억제 효과와는 달리 크게 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.

1:1, 1:1.5, 1;2, 1:2.5, 1:5의 비율의 혼합물의 활성 억제율은 각각 40%, 37%, 41%, 51%로 나타났다. 알부틴을 100㎕/㎖의 고농도로 단독 사용 시보다보다 알부틴 20㎕ /㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖ 혼합 시 tyrosinase의 활성 억제율이 26%에서 40%로 상승되는 것을 확인할 수 있었다.

5, 1:2. 1:2.5, 1:5로 알부틴의 함량이 증가하여도 유용성감초추출물 단독 사용대비 멜라닌 생성 억제에는 크게 효과가 없음을 확인하였다.

2. Mushroom tyrosinase의 생성 억제를 확인하는 시험에서 알부틴, 유용성감초추출물이 모두 농도 의존적으로 멜라닌을 형성하는 tyrosinase을 모두 억제하는 것을 확인할 수 있었으며 혼합물의 경우 알부틴과 유용성감초추출물의 단독 사용 시 보다 혼합비율에 따라 다르기는 하지만 억제율이 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

(Fig. 3 (c)) 알부틴20㎕/㎖의 농도에서 11%, 유용성감초추출물 20㎕/㎖의 농도에서 71%의 mushroom tyrosinase활성 억제율을 보이나 유용성감초추출물 20㎕/㎖과 알부틴을 20㎕/㎖를 혼합한 경우 알부틴단독 사용 시보다 그 효과가 매우 우수하였으며, 유용성감초추출물 단독 사용 대비 20%이상의 효능이 좋아지는 것을 확인할 수 있었다. 모든 혼합물은 알부틴 100㎕/㎖과 유용성감초추출물 20㎕/㎖과 비교하였을 때 유의차 있는 효능이 있음을 확인하였다.

3. B16 melanoma세포에서 tyrosinase 활성 억제 실험 결과 알부틴 보다는 유용성감초추출물의 효능이 좋음을 확인할 수 있었다. 알부틴을 100㎕/㎖의 고농도로 사용 시 26%의 활성 억제를 보이나 알부틴 20㎕/㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖을 1:1로 섞은 혼합물의 경우 51%의 활성 억제를 보여 2배 가까이 활성 억제율이 상승하였다.

4. B-16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과 실험 결과 알부틴의 경우 20㎕/㎖ ~ 100㎕/㎖의 고농도로 처리하여도 억제율이 20% 미만이었으나 유용성감초추출물은 20㎕/㎖의 농도에서도 34%의 멜라닌생성 억제 효과를 보여 유용성감초추출물의효능이 알부틴 보다 뛰어남을 확인할 수 있었다. 혼합물에서는 알부틴 20㎕/㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖을 1:1로 섞은 혼합물의 경우 알부틴 20㎕/㎖만 사용 시2%, 유용성감초추출물 20㎕/㎖만 사용 시 34%의 생성억제에서 52%로 효과가 좋아졌으나 그 이후 알부틴의 농도 증가에도멜라닌 생성 억제율은 크게 증가하지 않음 또한 확인할 수 있었다.

B16 세포를 이용하여 시험물질의 tyrosinase활성 억제 실험을 실시한 것으로 알부틴의 농도를 20, 30, 40, 50, 100 ㎕/㎖ 로 테스트 한 결과 20㎕/㎖에서 8%, 30㎕/㎖에서 9%, 40㎕/㎖에서 17%, 50㎕/㎖에서 20%, 100㎕/㎖에서 26%의 tyrosinase의 활성 억제를 보여주어 tyrosinase 활성 억제에 효과가 있음을 알 수 있었다. 유용성감초추출물의 경우엔 20 ㎕/㎖에서30%, 30㎕/㎖에서 38%, 40㎕/㎖에서 36%, 50㎕/㎖에서 51%의 활성 억제를 보여주었다.

(Fig. 1) Glabridin은 배양세포와 모르모토의 피부를 통해 glabridin이 멜라닌의 생성과 염증의 발생을 억제하는 효과를 조사한 결과 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성 효소(tyrosinase)의 활성을 억제하는 사실이 드러났으며, DNA합성에 미치는 영향은 전혀 인식되지 않았다. 모르모토에 중파장 자외선(UVB)을 조사하여 유도되는 색소침착증과 홍반현상은 glabridin을 함유하는 제재를 국소적으로 발라준 경우 억제되는 결과를 보여준다[5].

저농도의 혼합물에서 효능이 상승되는 것에는 의미가 있다고 보여지는 바이다. Mushroom tyrosinase 활성 억제와 비교하여 사용한 기질의 종류에 따라서 tyrosinase활성 억제율이 달라짐을 확인할 수 있었다.

두 성분은 L-tyrosine을 기질로 사용하였을 경우 tyrosinase의 억제효과가 잘 나타나는 것으로 보아 melanogenesis의 tyrosinase-related step 중 가장 처음 단계인 L-tyrosine에서 L-DOPA로 진행되는 과정을 주로 억제하는 것으로 판단된다.

알부틴과 유용성감초추출물은 이미 고시 원료로 안전성이 입증된 원료이긴 하지만 혼합물의 경우 혼합비에 따라 어떠한 양상을 보이는지 확인하였다. 먼저 알부틴과 유용성감초추출물을 각각 0~1000㎕/㎖ 의 다양한 농도로 조제하여 B16세포에 처리한 결과 control대비 알부틴은 1000㎕/㎖에서 약간의 세포 독성이, 유용성감초추출물은 100㎕/㎖의 농도에서 세포 독성을 보임을 알 수 있었다.(Fig.

먼저 알부틴과 유용성감초추출물의 mushroom tyrosinase의 활성 억제를 살펴본 결과 알부틴은 20㎕/㎖에서 11%, 30㎕/㎖에서17%, 40㎕/㎖에서 27%, 50㎕/㎖에서 38%, 100㎕/㎖에서 41%의 mushroom tyrosinase활성 억제력을 보여준다. 유용성감초추출물의 경우엔 20㎕/㎖에서 71%, 30㎕/㎖에서 75%, 40㎕/㎖에서 85%, 50㎕/㎖에서 88%의 tyrosinase활성억제력을 보여 알부틴에 비해 mushroom tyrosinase활성 억제력이 매우 좋은 것으로 나타났다.

5), 100㎕/㎖(1:5)의 비율로 증량하여 실험하였다. 모든 혼합물에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.(Fig.

3 (c)) 알부틴20㎕/㎖의 농도에서 11%, 유용성감초추출물 20㎕/㎖의 농도에서 71%의 mushroom tyrosinase활성 억제율을 보이나 유용성감초추출물 20㎕/㎖과 알부틴을 20㎕/㎖를 혼합한 경우 알부틴단독 사용 시보다 그 효과가 매우 우수하였으며, 유용성감초추출물 단독 사용 대비 20%이상의 효능이 좋아지는 것을 확인할 수 있었다. 모든 혼합물은 알부틴 100㎕/㎖과 유용성감초추출물 20㎕/㎖과 비교하였을 때 유의차 있는 효능이 있음을 확인하였다.(Fig.

알부틴의 농도를 20, 30, 40, 50, 100㎕/㎖로 테스트 한 결과 20㎕/㎖에서 2%, 30㎕/㎖에서 6%, 40㎕/㎖에서 13%, 50㎕/㎖에서 13%, 100㎕/㎖에서 18%의 멜라닌 생성 억제력을 보여주었으며 유용성감초추출물의 경우엔 20㎕/㎖에서 34%, 30㎕/㎖에서 42%, 40㎕/㎖에서 61%, 50㎕/㎖에서 63%의 억제력을 보여주었다. 실험결과에서 보는 바와 같이 유용성감초추출물의 효과가 더 우수하였다.(Fig.

5, 1:5의 비율의 혼합물의 활성 억제율은 각각 40%, 37%, 41%, 51%로 나타났다. 알부틴을 100㎕/㎖의 고농도로 단독 사용 시보다보다 알부틴 20㎕ /㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖ 혼합 시 tyrosinase의 활성 억제율이 26%에서 40%로 상승되는 것을 확인할 수 있었다. (Fig.

B16 melanoma세포에서 tyrosinase 활성 억제 실험 결과 알부틴 보다는 유용성감초추출물의 효능이 좋음을 확인할 수 있었다. 알부틴을 100㎕/㎖의 고농도로 사용 시 26%의 활성 억제를 보이나 알부틴 20㎕/㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖을 1:1로 섞은 혼합물의 경우 51%의 활성 억제를 보여 2배 가까이 활성 억제율이 상승하였다. 하지만 유용성감초추출물의 경우 단독으로 50㎕/㎖사용 시에도 B16 melanoma세포에서 tyrosinase 활성 억제 효과가 51%로 알부틴을 각 농도별로 혼합하여도 활성 억제에는 큰 의미가 없어 보이는 것을 확인하였다.

알부틴의 농도를 20, 30, 40, 50, 100㎕/㎖로 테스트 한 결과 20㎕/㎖에서 2%, 30㎕/㎖에서 6%, 40㎕/㎖에서 13%, 50㎕/㎖에서 13%, 100㎕/㎖에서 18%의 멜라닌 생성 억제력을 보여주었으며 유용성감초추출물의 경우엔 20㎕/㎖에서 34%, 30㎕/㎖에서 42%, 40㎕/㎖에서 61%, 50㎕/㎖에서 63%의 억제력을 보여주었다. 실험결과에서 보는 바와 같이 유용성감초추출물의 효과가 더 우수하였다.

B16 세포를 이용하여 시험물질의 tyrosinase활성 억제 실험을 실시한 것으로 알부틴의 농도를 20, 30, 40, 50, 100 ㎕/㎖ 로 테스트 한 결과 20㎕/㎖에서 8%, 30㎕/㎖에서 9%, 40㎕/㎖에서 17%, 50㎕/㎖에서 20%, 100㎕/㎖에서 26%의 tyrosinase의 활성 억제를 보여주어 tyrosinase 활성 억제에 효과가 있음을 알 수 있었다. 유용성감초추출물의 경우엔 20 ㎕/㎖에서30%, 30㎕/㎖에서 38%, 40㎕/㎖에서 36%, 50㎕/㎖에서 51%의 활성 억제를 보여주었다.(Fig.

먼저 알부틴과 유용성감초추출물의 mushroom tyrosinase의 활성 억제를 살펴본 결과 알부틴은 20㎕/㎖에서 11%, 30㎕/㎖에서17%, 40㎕/㎖에서 27%, 50㎕/㎖에서 38%, 100㎕/㎖에서 41%의 mushroom tyrosinase활성 억제력을 보여준다. 유용성감초추출물의 경우엔 20㎕/㎖에서 71%, 30㎕/㎖에서 75%, 40㎕/㎖에서 85%, 50㎕/㎖에서 88%의 tyrosinase활성억제력을 보여 알부틴에 비해 mushroom tyrosinase활성 억제력이 매우 좋은 것으로 나타났다.(Fig.

5, 1:5의 비율의 혼합물의 멜라닌 생성 억제율은 각각 52%, 55%, 58%, 56%, 54%로 나타났다. 이 결과로 보았을 때 혼합물의 경우 알부틴, 유용성감초추출물을 단독 사용 시 보다는 그 효능 효과가 좋아지긴 했으나 알부틴의 농도가 증가하여도 멜라닌 생성 억제력은 tyrosinase 억제 효과와는 달리 크게 증가하지 않음을 확인할 수 있었다. 멜라닌 형성 억제 효과에 있어서는 유용성감초추출물의 효과가 매우 우수하기에 알부틴과의 혼합물에 있어서는 각각 20㎕/㎖씩 1:1로 혼합한 혼합물 이외에는 크게 의미가 없는 것으로 보여 지는 바이다.

이로서 알부틴과 유용성감초추출물은 이미 미백고시 성분으로 입증된 효과와 같이 멜라닌 생성에 영향을 주는 enzyme인 tyrosinase 활성 억제에 우수한 효능을 보여주는 것을 확인하였으며 비율에 따라 다르기는 하지만 혼합물의 경우 특히, mushroom tyrosinase 활성 억제에는 매우 효과가 있음을 실험으로 확인할 수 있었다. 하지만 B-16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 억제에서는 알부틴은 크게 효과가 없었으며 유용성감초추출물의 효과는 우수하였다.

OD값은 mushroom tyrosinase의 활성이 높을수록 흡광도의 수치가 높게 나타나는 반면, mushroom tyrosinase의 활성을 억제하는 시료가 첨가될 경우, 흡광도 수치가 낮게 나타난다. 평가방법은 시료에 의해 tyrosinase activity inhibition 수치가 클수록 tyrosinase 억제제로서 효과적으로 작용한다고 판별한다.

평가방법은 시료에 의해 tyrosinase활성이 감소할수록 피부 색소 억제제로서 효과적으로 작용한다고 판별한다.

평가방법은 시료에 의해 멜라닌 양이 감소할수록 피부 색소 억제제로서 효과적으로 작용한다고 판별한다.

이로서 알부틴과 유용성감초추출물은 이미 미백고시 성분으로 입증된 효과와 같이 멜라닌 생성에 영향을 주는 enzyme인 tyrosinase 활성 억제에 우수한 효능을 보여주는 것을 확인하였으며 비율에 따라 다르기는 하지만 혼합물의 경우 특히, mushroom tyrosinase 활성 억제에는 매우 효과가 있음을 실험으로 확인할 수 있었다. 하지만 B-16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 억제에서는 알부틴은 크게 효과가 없었으며 유용성감초추출물의 효과는 우수하였다. B-16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 억제 혼합물의 경우 1:1로 혼합한 경우 단독 사용 시 보다 그 효과가 좋아졌으나 1:1.

알부틴을 100㎕/㎖의 고농도로 사용 시 26%의 활성 억제를 보이나 알부틴 20㎕/㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖을 1:1로 섞은 혼합물의 경우 51%의 활성 억제를 보여 2배 가까이 활성 억제율이 상승하였다. 하지만 유용성감초추출물의 경우 단독으로 50㎕/㎖사용 시에도 B16 melanoma세포에서 tyrosinase 활성 억제 효과가 51%로 알부틴을 각 농도별로 혼합하여도 활성 억제에는 큰 의미가 없어 보이는 것을 확인하였다. 저농도의 혼합물에서 효능이 상승되는 것에는 의미가 있다고 보여지는 바이다.

B-16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과 실험 결과 알부틴의 경우 20㎕/㎖ ~ 100㎕/㎖의 고농도로 처리하여도 억제율이 20% 미만이었으나 유용성감초추출물은 20㎕/㎖의 농도에서도 34%의 멜라닌생성 억제 효과를 보여 유용성감초추출물의효능이 알부틴 보다 뛰어남을 확인할 수 있었다. 혼합물에서는 알부틴 20㎕/㎖와 유용성감초추출물 20㎕/㎖을 1:1로 섞은 혼합물의 경우 알부틴 20㎕/㎖만 사용 시2%, 유용성감초추출물 20㎕/㎖만 사용 시 34%의 생성억제에서 52%로 효과가 좋아졌으나 그 이후 알부틴의 농도 증가에도멜라닌 생성 억제율은 크게 증가하지 않음 또한 확인할 수 있었다.

이 외에도 미백활성이 있는 물질이 다수 존재하기에 이 실험만으로 미백활성 물질을 혼합하여 사용함에 의해 모든 물질이 미백활성이 증가되는 것은 아니라고 생각한다. 좀 더 다양한 농도에서의 확인 뿐 아니라 알부틴과 유용성감초추출물 이외의 다른 시험 물질의 혼합에 의해서도 미백활성이 증가됨을 확인할 필요가 있으며 실제 임상실험을 통한 확인도 필요하다고 사료되는 바이다.

추후 멜라닌 생성과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 microphthalmia-associated transcription factor(MITF), cAMP response element(CRE) 등[16]과 같은 인자들에 대해 혼합물이 어떤 영향을 미치는지에 대한 후속 연구 외에 임상 연구 등의 다양한 연구를 통해 미백에 실제적으로 효과가 있음을 확인하여 기존의 소재들을 재활용하는 차원에서의 연구가 필요할 것으로 생각된다.