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문제 정의
- 이 논문에서는 COG database에 보고된 711종의 균주들 중에서 M. genitalium 보다 작은 수의 orthologs를 가진 원핵생물들이 가지는 보존적 유전자를 파악하고 상호 비교하여 공통점과 차이점을 파악하여 생명현상과의 관계를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Mycgen 이외의 분석대상그룹에 존재하는 보존적 유전자를 비교하였다. 분석대상 15개 원핵생물 중 Candidatus Phytoplasma에 속하는 균주는 Astyel, Oniyel, Phyaus, Strlet 등 4개였다(Table 1).
- Ortholog에서 유래한 COG의 보유유무를 bootstrap (n=1,000)을 적용하여 작성한 분석대상 원핵생물들의 Maximum Likelihood (ML) 계통수를 Fig. 1에 나타내었다. Neighborjoining, UPGMA, maximum parsimony 계통수에서도 아주 유사한 형태를 보였다.
- 분석대상 원핵생물들이 보유한 orthologs 비교를 위하여COG database에서[3] 확보한 자료를 이용하였다. 분석대상생물종이 전체 4,631개의 각 COG를 보유하고 있는 지를 MS사의 엑셀프로그램(ver. 10)을 이용하여 행렬로 작성하였다[12]. 이후 15개의 분석대상 원핵생물 사이에 공통적인 COG 번호를 통해 보존적 유전자를 검색하였고, Mycgen과 공통적인 것과 Mycgen 이외의 분석대상에만 존재하는 COG 등으로 나누어 분석하였다.
- 10)을 이용하여 행렬로 작성하였다[12]. 이후 15개의 분석대상 원핵생물 사이에 공통적인 COG 번호를 통해 보존적 유전자를 검색하였고, Mycgen과 공통적인 것과 Mycgen 이외의 분석대상에만 존재하는 COG 등으로 나누어 분석하였다.
- capricolum 기반의 인공세균을 개발하여 배지에서 생장과 세포분열이 가능한 것을 보았다[8]. 즉 보존적 유전자를 이용하여 인공의 원핵생물을 합성하였다.
- 행렬로 작성된 분석대상 원핵생물들이 4,631개의 각 COG를 보유하는 지를 토대로 ortholog 보유 계통수를 작성하였다. Mega 프로그램(ver.
대상 데이터
- 또한 Candidatus Phytoplasma에 속하는 구성원 서로간의 유연관계가 높지 않다는 보고[2]도 있었다. Mycgen에는 없고 Candidatus Phytoplasma에만 존재하는 기능범주와 COG는 기능범주 Q (Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism) 관련 COG4869(Propanediol utilization protein), 기능범주 U (Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport) 관련 COG1272(Predicted membrane channel-forming protein YqfA, hemolysin III family), 기능범주 X (Mobilome: prophages, transposons) 관련 COG2801 (Transposase InsO and inactivated derivatives), 그리고 복합기능인 기능범주 FV 관련 COG0756(dUTPase)과 기능범주 ET 관련 COG0834 (ABC-type amino acid transport/signal transduction system, periplasmic component/domain) 등 총 5개 였다. 분석대상 Candidatus Phytoplasma들은 식물에 기생하고 Mycgen은 동물에 기생하는데 보유하는 COG에서도 Candidatus Phytoplasma들에만 존재하는 COG가 있어, 이들은 Mycgen 및 분석대상 다른 원핵생물들과 구별되는 생명현상을 나타나는 것으로 유추할 수 있었다.
- 고세균은 Nanoarchaeum equitans Kin4-M (이하 Nanequ)만 있었다. 각 원핵생물이 함유하고 있는 보존적 유전자인 COG 자료는COG database에서 확보하였다[3]. 유전체의 크기, 총 유전자개수, 단백질 유전자 개수 등의 자료는 BioCyc Database Collection을 이용하였다[1].
- Mycgen 이외의 분석대상그룹에 존재하는 보존적 유전자를 비교하였다. 분석대상 15개 원핵생물 중 Candidatus Phytoplasma에 속하는 균주는 Astyel, Oniyel, Phyaus, Strlet 등 4개였다(Table 1). 이들은 Mycgen과 함께 Mollicutes 강(class)에 속하며 식물의 세포내부에 기생하는 병원체이다.
- Table 1에 게놈의 크기를 기준으로 분석 대상 각 원핵생물의 게놈 크기, GC 비율(%), Mycgen과의 공통 COG의 개수와 비율(%) 등을 나타내었다. 분석대상 원핵생물들은 명명법이 Candidatus로 시작되는 것이 총 13개로, 이들은 시험관에서 배양이 불가능하다. Candidatus Phytoplasma 속(genus)은 형태적으로 mycoplasma와 유사한 원핵생물들을 이르는 용어로 구성원 서로간의 유연관계가 높지 않다[2].
- 분석대상 원핵생물들이 보유한 orthologs 비교를 위하여COG database에서[3] 확보한 자료를 이용하였다. 분석대상생물종이 전체 4,631개의 각 COG를 보유하고 있는 지를 MS사의 엑셀프로그램(ver.
- 각 원핵생물이 함유하고 있는 보존적 유전자인 COG 자료는COG database에서 확보하였다[3]. 유전체의 크기, 총 유전자개수, 단백질 유전자 개수 등의 자료는 BioCyc Database Collection을 이용하였다[1]. M.
이론/모형
- 행렬로 작성된 분석대상 원핵생물들이 4,631개의 각 COG를 보유하는 지를 토대로 ortholog 보유 계통수를 작성하였다. Mega 프로그램(ver. 6.06)의 phylogeny analysis를 이용하여 phylogenetic tree를 작성하면서 bootstrap method (n=1,000)로 분석하였다.
성능/효과
- 1%로 나타났다. 17% 이하의 GC 비율을 보인 원핵생물은 Nasdel, Carrud, Zinins의 3종이고 30% 이상의 비율은 Trephe (42.1%), Uzidia (30.2%), Nanequ (31.6%), Mycgen (31.7%)의 4종으로, 초고온성 고세균인 Nanequ는 중온성인 Mycgen과 유사하였다. 대장균이 50% 수준의 GC 비율을 보이므로 Trephe와 고온성인 Nanequ는 높지 않다고 할 수 있었다.
- 44%로 나타났다. 382개의 COG를 균주별로 보면 Nanequ가 219개, Syndia가 78개였고 나머지는 1~21개 사이였다. 즉 초고온성 고세균인 Nanequ와 polyketide 독소를 합성하여 공생곤충을 보호하는 Syndia가[15] Mycgen과 많은 생리적 차이를 보인다고 할 수 있었다.
- 현재까지 인공적으로 단독배양이 가능하다고 보고된 원핵생물들 중에서 Mycgen은 최소의 게놈크기를 가지고 있고 367개의 COG를 가지고 있으며 비교대상으로 많이 활용된다[6,8]. Table 1에서 Mycgen과 공통적인 COG의 수를 보면 Mycgen보다 게놈이 큰 4개의 원핵생물들은 240~246개 COG가(74.62~76.64%), Mycgen보다 게놈이 작은 원핵생물들은 66~180개(27.17~64.08%)의 COG가 Mycgen과 공통이었다. 그리고 각 원핵생물이 보유한 COG 종류와 Mycgen의 COG와의 공통비율도 Mycgen보다 게놈이 큰 4개의 원핵생물들은 74.
- 이는 분석대상 원핵생물들이 보유한 ortholog의 분포가 서로 차이를 보이며, 서로 다른 생명현상과 연관이 있을 것으로 판단되었다. 각 분기점에서 생물종까지의 거리를 보면 Candidatus Phytoplasma 속에 비해 곤충공생 원핵생물9균주가 길었다. 이는 Candidatus Phytoplasma 속들의 유연관계가 곤충공생 원핵생물들 보다 높은 것을 나타내는 것으로‘각 분석대상그룹의 보존적 유전자’의 결과의 공통 COG의 수와 상통하는 것으로 판단되었다.
- 게놈의 크기는 112,091~959,779 염기쌍(base pairs, bp), GC비율은 13.5~42.1%, Mycgen의 367개 COG와 공통인 COG의 개수는 66~244개, 각 원핵생물이 보유한 전체 단백질 중 COG가 차지하는 비율은 29.36~98.24% 범위였다. Trephe, Uzidia, Sulmue, Syndia, Mycgen, Phyaus 등의 원핵생물은 단백질유전자 수와 RNA 유전자 수 그리고 전체 유전자 수가 일치하지 않았는데, 이는 가짜 유전자(pseudogene)까지 유전자로 계산하여 나타난 결과이다[1].
- Neighborjoining, UPGMA, maximum parsimony 계통수에서도 아주 유사한 형태를 보였다. 결과를 보면 첫째 Candidatus Phytoplasma 속 4균주와 곤충공생 원핵생물 9균주가 서로 다른 분류그룹으로 나누어졌다. 둘째 보유 COG의 수가 103, 125, 186개인 Nasdel, Hodcic, Zinins 그리고 165, 155, 223, 226개인T rephe, Carrud, Uzidia, Sulmue 등이 높은 유연관계를 보여 단순히 COG의 보유개수가 계통수에 반영된 것은 아닌 것으로 유추되었다.
- 총 29개의 COG가 15종의 원핵생물에 공통적이었다. 관련 COG의 기능과 기능범주(functional category)로 나타내면 가장 개수가 많은 것은 번역관련(기능범주 J)으로 총25개 중 tRNA-synthetase(COG0008), 번역개시인자(COG0361), 번역신장인자(COG0480)가 1개씩이고 22개가 리보솜 구성단백질이었다(Table 2). 전사관련(기능범주 K) COG는 COG0085, COG0086, COG0202로 모두 RNA 중합효소의 소단위체였고, 기능범주 O의COG0459는 chaperonin GroEL로 단백질의 접힘(folding)에 관여한다.
- 08%)의 COG가 Mycgen과 공통이었다. 그리고 각 원핵생물이 보유한 COG 종류와 Mycgen의 COG와의 공통비율도 Mycgen보다 게놈이 큰 4개의 원핵생물들은 74.62~76.64%, Mycgen보다 게놈이 작은 원핵생물들은 27.17~64.08%의 범위였다. 즉 게놈크기가 작을수록 Mycgen과의 공통 COG의 수와 비율이 작아 생명현상이 Mycgen과 차이를 보일 가능성이 있는 것으로 판단되었다.
- 동일COG라도 아미노산서열에 차이를 보이는데 서열이 다른 α 소단위체가 다양한 환경에서 각 원핵생물들의 생존에 도움을 주는 것으로 판단할 수 있었다.
- 결과를 보면 첫째 Candidatus Phytoplasma 속 4균주와 곤충공생 원핵생물 9균주가 서로 다른 분류그룹으로 나누어졌다. 둘째 보유 COG의 수가 103, 125, 186개인 Nasdel, Hodcic, Zinins 그리고 165, 155, 223, 226개인T rephe, Carrud, Uzidia, Sulmue 등이 높은 유연관계를 보여 단순히 COG의 보유개수가 계통수에 반영된 것은 아닌 것으로 유추되었다. 이는 분석대상 원핵생물들이 보유한 ortholog의 분포가 서로 차이를 보이며, 서로 다른 생명현상과 연관이 있을 것으로 판단되었다.
- 분석대상 15종 모두에 존재하는 COG의 수는 29개 이고, Mycgen에만 존재하는 COG의 수는 83개였다. 따라서 Mycgen이 보유한 367개의 COG 중에서 Mycgen과 나머지 비교대상 원핵생물들이 공유하는 COG의 종류는 총 284개였다. 한편 Mycgen에 없고 11종 이상의 원핵생물들이 공통적으로 보유하는 COG는 없었고, Mycgen에 없고 1~10종의 원핵생물이 보유하는 COG는 총 632개 였다(Table 2).
- 실제로 Escherichiacoli O157:H7은 140개, Bacillus subtilis 168은 184개의 rRNA유전자를 보유하고 있었다[7]. 따라서 분석대상 원핵생물들은 모두 성장속도가 느리며 외부환경의 변화에 빠른 대응이 힘들 것으로 사료되었다. Mycgen을 제외한 분석대상 14개 균주 중 Nanequ를 제외한 나머지 13개 균주는 모두 세포내 병원체 혹은 공생체로 숙주 세포내부의 환경은 세포외부 환경보다 변화가 적을 것이며, rRNA 유전자 개수가 작아도 생존이 가능하였을 것이다.
- 일반적으로 비교대상 생물의 수가 증가하면 공통 COG의 수는 감소하는데, 본 연구에서는 분석대상 원핵생물의 수가 15개로 708개에[12] 비해 월등히 작지만 공통 COG의 수는 크게 차이가 나지 않았다. 또한 본 연구에서 파악된 공통적 COG 29개는 모두 703종 이상의 공통적 COG에 포함되어[12], 본 연구의공통적 COG가 원핵생물의 생명유지에 중요한 것으로 판단되었다.
- COG0539는 비교대상 나머지 원핵생물에는 없지만 COG 데이타베이스의 711개 원핵생물 중 614개의 원핵생물에 존재하여, COG0539의 분포와Candidatus들의 특징을 설명하기는 어려웠다. 또한 총 291개의COG가 분석대상 15개 원핵생물 중 하나 이상의 곤충에 공생하는 Candidatus들에 있어, 이들 사이에 보존적 유전자의 분포 즉 생리적 현상 등이 다양할 가능성이 있는 것으로 유추되었다.
- 분석대상 15개 원핵생물 중 Candidatus Phytoplasma를 제외한 나머지 9개의 Candidatus들은 곤충에 공생한다는 공통점 외에 속(genus)은 모두 달랐다(Table 1). 이 곤충에 공생하는9개의 Candidatus들에서만 발견되는 COG는 Ribosomal protein S1인 COG0539 하나뿐이었다.
- Table 2에 Mycgen에도 분포하며 나머지 분석대상 14종의 원핵생물들 1~14종에 존재하는 COG의 개수를 나타내었다. 분석대상 15종 모두에 존재하는 COG의 수는 29개 이고, Mycgen에만 존재하는 COG의 수는 83개였다. 따라서 Mycgen이 보유한 367개의 COG 중에서 Mycgen과 나머지 비교대상 원핵생물들이 공유하는 COG의 종류는 총 284개였다.
- Mycgen에는 없고 Candidatus Phytoplasma에만 존재하는 기능범주와 COG는 기능범주 Q (Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism) 관련 COG4869(Propanediol utilization protein), 기능범주 U (Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport) 관련 COG1272(Predicted membrane channel-forming protein YqfA, hemolysin III family), 기능범주 X (Mobilome: prophages, transposons) 관련 COG2801 (Transposase InsO and inactivated derivatives), 그리고 복합기능인 기능범주 FV 관련 COG0756(dUTPase)과 기능범주 ET 관련 COG0834 (ABC-type amino acid transport/signal transduction system, periplasmic component/domain) 등 총 5개 였다. 분석대상 Candidatus Phytoplasma들은 식물에 기생하고 Mycgen은 동물에 기생하는데 보유하는 COG에서도 Candidatus Phytoplasma들에만 존재하는 COG가 있어, 이들은 Mycgen 및 분석대상 다른 원핵생물들과 구별되는 생명현상을 나타나는 것으로 유추할 수 있었다. 하지만 COG 데이타베이스의 711개 원핵생물 중COG4869는 69개, COG1272는 308개, COG2801은 461개, COG0756은 492개, COG0834는 531개의 원핵생물에 분포하여[3] 이들 COG가 식물체에의 기생과 관련되는 지는 확신할 수 없었다.
- 비교대상 원핵생물 711종 모두에 공통적인 COG는 COG0080 (Ribosomal protein L21) 1개, 708종 이상에서는 22개의COG와 703종 이상은 49개의 COG가 공통이었다[12]. 일반적으로 비교대상 생물의 수가 증가하면 공통 COG의 수는 감소하는데, 본 연구에서는 분석대상 원핵생물의 수가 15개로 708개에[12] 비해 월등히 작지만 공통 COG의 수는 크게 차이가 나지 않았다.
- 전사관련(기능범주 K) COG는 COG0085, COG0086, COG0202로 모두 RNA 중합효소의 소단위체였고, 기능범주 O의COG0459는 chaperonin GroEL로 단백질의 접힘(folding)에 관여한다. 연구대상 균주들의 공통 COG는 모두 RNA와 리보솜 그리고 단백질 접힘에 관계하여 생명현상에서 단백질이 중요함을 알려주는 것으로 사료되었다. 전사관련(기능범주 K)COG0202는 RNA 중합효소의 α 소단위체로 전사의 핵심역할을 수행하는데, α 소단위체의 돌연변이는 부탄올 등의 용제에 내성이 강한 세균 등 다양한 표현형을 나타내었다[10].
- 3%)가 Nanequ에만 존재하였다. 이로서 비교대상 원핵생물들 중 유일한 고세균인 Nanequ가 다른 원핵생물들에 비해 독특한 단백질과 생명현상을 나타내는 것으로 유추할 수 있었다.
- 한편 Mycgen에 없고 11종 이상의 원핵생물들이 공통적으로 보유하는 COG는 없었고, Mycgen에 없고 1~10종의 원핵생물이 보유하는 COG는 총 632개 였다(Table 2). 이중 Mycgen에 없고 단 하나의 원핵생물에 존재하는 COG의 수가 382개로 전체632개중 60.44%로 나타났다. 382개의 COG를 균주별로 보면 Nanequ가 219개, Syndia가 78개였고 나머지는 1~21개 사이였다.
- 비교대상 원핵생물 711종 모두에 공통적인 COG는 COG0080 (Ribosomal protein L21) 1개, 708종 이상에서는 22개의COG와 703종 이상은 49개의 COG가 공통이었다[12]. 일반적으로 비교대상 생물의 수가 증가하면 공통 COG의 수는 감소하는데, 본 연구에서는 분석대상 원핵생물의 수가 15개로 708개에[12] 비해 월등히 작지만 공통 COG의 수는 크게 차이가 나지 않았다. 또한 본 연구에서 파악된 공통적 COG 29개는 모두 703종 이상의 공통적 COG에 포함되어[12], 본 연구의공통적 COG가 원핵생물의 생명유지에 중요한 것으로 판단되었다.
- 전체 단백질 중 COG가 차지하는 비율은 Candidatus Phytoplasma 속의 원핵생물들이 29.36~49.63%로 비교대상 다른 원핵생물들의 63.96~98.24%보다 낮았다(Table 1). COG는 3종류이상의 원핵생물에 분포하므로 이들은 비교대상 다른 원핵생물들과 구분되는 독자적인 생명현상을 많이 나타낼 것으로 유추되었다.
- 08%의 범위였다. 즉 게놈크기가 작을수록 Mycgen과의 공통 COG의 수와 비율이 작아 생명현상이 Mycgen과 차이를 보일 가능성이 있는 것으로 판단되었다.
- 분석대상 15개 원핵생물 중 Candidatus Phytoplasma 속 4개 균주 모두에서만 존재하는 40개 COG의 기능범주와 번호를 Table 3에 나타내었다. 총 100개의 COG가 분석대상 15개 원핵생물 중 하나이상의 Candidatus Phytoplasma에만 존재하여, Candidatus Phytoplasma속 4개 균주 사이에도 보존적 유전자의 다양성이 있는 것으로 판단되었다. 또한 Candidatus Phytoplasma에 속하는 구성원 서로간의 유연관계가 높지 않다는 보고[2]도 있었다.
- Table 3에 분석대상 15종의 원핵생물 게놈 모두에 존재하는COG의 기능범주와 COG 번호를 나타내었다. 총 29개의 COG가 15종의 원핵생물에 공통적이었다. 관련 COG의 기능과 기능범주(functional category)로 나타내면 가장 개수가 많은 것은 번역관련(기능범주 J)으로 총25개 중 tRNA-synthetase(COG0008), 번역개시인자(COG0361), 번역신장인자(COG0480)가 1개씩이고 22개가 리보솜 구성단백질이었다(Table 2).
- 따라서 Mycgen이 보유한 367개의 COG 중에서 Mycgen과 나머지 비교대상 원핵생물들이 공유하는 COG의 종류는 총 284개였다. 한편 Mycgen에 없고 11종 이상의 원핵생물들이 공통적으로 보유하는 COG는 없었고, Mycgen에 없고 1~10종의 원핵생물이 보유하는 COG는 총 632개 였다(Table 2). 이중 Mycgen에 없고 단 하나의 원핵생물에 존재하는 COG의 수가 382개로 전체632개중 60.
후속연구
- 또한 속- 혹은 종-특이적으로 존재하며 다른 계보(lineage)에는 존재하지 않는 고아 유전자(Orphangenes)가 특정 생물들의 독특한 생명현상에 관여할 수도 있다[18]. COG는 3가지 이상의 생물들에 분포하므로[4, 12] 속-특이적 COG 등이 존재하는 지 향후 연구를 통해 밝힐 수 있을 것이다.
- 전사공학(transcriptional engineering)과 균주공학(strainengineering)으로 RNA 중합효소의 소단위체에 돌연변이를 유도하여 부탄올 등의 용제에 내성이 강한 균주 생산[10] 외에 항생제 대량생산도 가능한 것으로 보고되고 있다. 균주개량에는 서열기반법과 무작위법의 두 가지가 있는데 본 연구에서 활용한 COG는 기능과 서열에 기반하므로[4, 17] 균주개량의 기초자료가 될 수 있을 것이다. 즉 전사공학, 균주공학, 합성생물학 등을 통하여 아미노산, 항생제, 의약품, 유기합성 전구체등을 효율적으로 합성하는 영역 등에 기초자료로 활용이 가능할 것이다.
- 균주개량에는 서열기반법과 무작위법의 두 가지가 있는데 본 연구에서 활용한 COG는 기능과 서열에 기반하므로[4, 17] 균주개량의 기초자료가 될 수 있을 것이다. 즉 전사공학, 균주공학, 합성생물학 등을 통하여 아미노산, 항생제, 의약품, 유기합성 전구체등을 효율적으로 합성하는 영역 등에 기초자료로 활용이 가능할 것이다.
- 하지만 이러한 결과는 각 그룹별로 분석대상 원핵생물들의 수가 적다는 한계가 있어, 향후 분석대상 원핵생물들의 수를 확대하면 각 분석대상그룹의 보존적 유전자 파악에 도움이 될 것으로 판단되었다. 또한 속- 혹은 종-특이적으로 존재하며 다른 계보(lineage)에는 존재하지 않는 고아 유전자(Orphangenes)가 특정 생물들의 독특한 생명현상에 관여할 수도 있다[18].
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