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문제 정의
- 본 연구의 목적은 이전 Bae et al. (2016)의 연구에서 절편으로 활용한 마디와 더불어 버려졌던 뿌리와 잎 절편으로부터 캘루스를 유도･증식 한 후 이로부터 식물체를 재분화 시키는 일련의 배양조건을 구명하는데 있다. 본 연구를 통해 얻을 수 있는 캘루스로부터 재분화된 유식물체는 기내증식(Bae et al.
- 우리나라에서 멸종위기 해안식물로 지정된 갯봄맞이의 캘루스배양을 통한 재분화 프로토콜을 보고한다. 마디배양을 통해 육성한 기내 유식물체의 절편은 유전자형, 절편의 종류, 광조건 및 2,4-D 첨가농도에 따라 캘루스 형성에 상이한반응을 보였다.
제안 방법
- ‘PT’ 캘루스를 zeatin 1.0mg/L 첨가한 배지에서 암배양 함으로써 얻어진 신초를 기 보고된 마디배양(Bae et al. 2016)을 위한 재료로 활용하기 위해 재분화된 신초를 생장조절제 무첨가 MS배지에 이식한 후 명배양 하였다.
- 2,4-D 1.0 또는 3.0mg/L 첨가배지에 ‘RT’ 마디를 배양하여 유기된 캘루스와 2,4-D 0.1 또는 1.0mg/L 첨가배지에 ‘PT’ 뿌리를 배양하여 유기된 캘루스를 대상으로 각각 동일한 조성의 배지에 이식하여 연속 암배양 하면서 캘루스의 증식을 도모하였다.
- 캘루스 clump는 Petri접시당 9개를 치상 하였으며 처리당 5개의 Petri접시를 사용하였다. 8주후 재분화 양상을 조사하였다.
- 8로 조정된 MS배지를 사용하였다. Petri접시당 동일부위 절편 5개를 치상하였고 처리마다 10개 Petri접시를 사용하였다. 배양물은 25±2℃에서 명배양(16hr 70μmol･m-2･s-1/8hr darkness) 또는 연속 암배양 하였다.
- 각 유전자형에서 생장이 가장 왕성하였던 처리에서 유래한 캘루스를 생장조절제 무첨가 배지와 3종의 시토키닌(BA,zeatin, TDZ)이 각각 1.0mg/L 첨가된 배지에 이식하고 광조건을 달리하여 배양함으로써 재분화를 유도하였다. ‘RT’ 캘루스는 명･암배양 모두에서 대부분 미미하게 생장하거나 일부 생장이 지속된 것이라 할지라도 흰색 또는 수화된 불투명한 외형을 나타내다가 갈변하였으며, 명배양에서는 아주 드물게 붉은색 색소가 침착된 캘루스가 생장하였다(자료 미제시).
- 각 유전자형에서 증식 정도가 가장 우수한 처리에서 유래한 캘루스를 선택하여 직경 약 5mm clump로 분할한 후 시토키닌의 종류는 다르고 농도는 1.0mg/L로 고정되어 첨가된 배지에치상한 후 명배양 또는 연속 암배양 하며 재분화를 유도하였다. 캘루스 clump는 Petri접시당 9개를 치상 하였으며 처리당 5개의 Petri접시를 사용하였다.
- 관수 후 plug tray는 55×35×15cm 플라스틱 박스에 넣고 박스 상부를 투명한 필름으로 씌운 후배양실(25±2℃, 16hr 70 μmol･m-2･s-1/8hr darkness, RH 65%)에서 기외 순화를 진행하였다.
- 암배양한 ‘PT’ 유전자형 캘루스에서 재분화된 신초를 식물 생장조절제 무첨가 MS배지에 치상하여 명배양 함으로써 식물체의 녹화, 발근 및 생장을 유도하였다.
- 유전자형, 절편의 종류, 2,4-D 첨가농도 및 광조건을 달리한 총 24처리에서 캘루스 형성율과 발생한 캘루스의 양을 조사한 후 각 유전자형에서 우수한 성적을 나타낸 상위 2개 처리에서 얻어진 캘루스를 직경 약 3mm로 분할하여 동일한 조성의 배지로 각각 이식한 후 연속 암조건으로 배양하며 그 증식을 유도하였다. Petri접시당 9개 캘루스 clump를 치상하였으며 처리당 10개 Petri접시를 사용하였다.
- 배양물은 25±2℃에서 명배양(16hr 70μmol･m-2･s-1/8hr darkness) 또는 연속 암배양 하였다. 절편을 캘루스 유도배지에 치상한 8주 후 캘루스 형성 정도를 조사하였다.
- 0mg/L로 고정되어 첨가된 배지에치상한 후 명배양 또는 연속 암배양 하며 재분화를 유도하였다. 캘루스 clump는 Petri접시당 9개를 치상 하였으며 처리당 5개의 Petri접시를 사용하였다. 8주후 재분화 양상을 조사하였다.
대상 데이터
- 유전자형, 절편의 종류, 2,4-D 첨가농도 및 광조건을 달리한 총 24처리에서 캘루스 형성율과 발생한 캘루스의 양을 조사한 후 각 유전자형에서 우수한 성적을 나타낸 상위 2개 처리에서 얻어진 캘루스를 직경 약 3mm로 분할하여 동일한 조성의 배지로 각각 이식한 후 연속 암조건으로 배양하며 그 증식을 유도하였다. Petri접시당 9개 캘루스 clump를 치상하였으며 처리당 10개 Petri접시를 사용하였다. 캘루스 증식 정도는 배양 5주후 조사하였다.
- 갯봄맞이 식물체의 줄기와 꽃의 색을 기준으로 Bae et al. (2016)이 구분한 ‘Red type’ (RT)과 ‘Pistachio type’ (PT) 등 2개 유전자형을 본 연구를 위한 재료로 사용하였다(Fig. 1A, 1B).
- 순화가 완료된 식물체는 8월 상순 경북대학교 상주캠퍼스의 무가온 플라스틱 필름 온실(coordinate N36˚22’46”/E128˚08’51”)에서 수돗물로 관수하며 자연기상 하에서 재배하였고 그 생육과정을 이듬해까지 관찰하였다.
- 증식된 유식물체(초장 약 4cm)에서 절편을 취하여 캘루스 유도용 재료로 사용하였는데, 절편으로는 각 유전자형의 유식물체로부터 액아를 포함하는 약 0.5cm 길이의 마디, 근단을 포함하는 약 1.0cm 길이의 뿌리 및 ‘PT’에서만은 추가적으로 잎 전체가 사용되었다.
- 캘루스 유도용 배지로 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D:Sigma-Aldrich) 0.1~3.0mg/L, sucrose (Duchefa Biochemie) 30g/L 및 Plant agar (Duchefa Biochemie) 8g/L가 첨가되고 pH는 5.8로 조정된 MS배지를 사용하였다. Petri접시당 동일부위 절편 5개를 치상하였고 처리마다 10개 Petri접시를 사용하였다.
이론/모형
- 암배양한 ‘PT’ 유전자형 캘루스에서 재분화된 신초를 식물 생장조절제 무첨가 MS배지에 치상하여 명배양 함으로써 식물체의 녹화, 발근 및 생장을 유도하였다. 생장한 유식물체는 서언에 언급한 바와 같이 기 보고된 갯봄맞이의 마디배양을 통한 증식체계와 통합하고자 Bae et al. (2016)의 방법에 따라 마디 배양을 수행하여 다신초를 획득하였다(결과 및 고찰 참조). 기내에서 증식된 다신초는 뿌리 등에 묻은 배지를 흐르는 수돗물로 완전히 제거한 후 상업용 상토(참사랑,Nongwoo Bio, Korea)가 담긴 50공 plug tray에 이식한 후 수돗물로 상토를 포화시켰다.
성능/효과
- 우리나라에서 멸종위기 해안식물로 지정된 갯봄맞이의 캘루스배양을 통한 재분화 프로토콜을 보고한다. 마디배양을 통해 육성한 기내 유식물체의 절편은 유전자형, 절편의 종류, 광조건 및 2,4-D 첨가농도에 따라 캘루스 형성에 상이한반응을 보였다. 특히, 다른 처리와는 무관하게 연속 암배양이 절편으로부터 캘루스 유도에 결정적인 영향을 미쳤다.
- 반면, ‘PT’ 명배양 캘루스는 생장과 더불어 녹화가 진행되었고 배양 6주후부터 생장조절제 무첨가 배지 및 zeatin과 TDZ가 1.0mg/L 첨가된 각각의 배지에서 마디구조(nodular structure)가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 2A).
- 2016)를 통해 확인할 수 있지만 갯봄맞이가 속한 Glaux 속 식물의 기내배양을 통한 캘루스 유도에 관한 보고는 찾아볼 수 없다. 본 연구의 결과는 갯봄맞이 캘루스 유도에 암배양이 필수적일 수도 있다는 것을 나타낸다.
- 0mg/L 첨가배지에 ‘PT’ 뿌리를 배양하여 유기된 캘루스를 대상으로 각각 동일한 조성의 배지에 이식하여 연속 암배양 하면서 캘루스의 증식을 도모하였다. 생장 정도에 약간의 차이는 있었지만 모든 캘루스가 왕성하게 생장하여 증식되었고 증식된 캘루스는 절편 또는 유전자형에 따른 외형적 차이가 관찰되지 않았다(Table 2; Fig. 1D).
- 한편 ‘PT’의 암배양 캘루스는 4종의 신초유도 배지 모두에서 생장을 지속하였으며 녹색 또는 붉은색 색소는 관찰되지 않았다. 생장조절제 무첨가 배지와 zeatin 1.0mg/L 첨가배지에서 배양 6주후 명배양에서와 마찬가지로 뚜렷한 마디구조가 관찰되었고 zeatin 1.0mg/L 첨가배지에서만 마디구조 일부(24.4%)가 정상적 신초로 분화하였다(Fig. 2A). 이 경우 뿌리구조는 관찰되지 않았다.
- 연속 암조건에서 zeatin 1.0mg/L 첨가배지에 ‘Pistachio’ 유전자형의 캘루스를 배양했을 때만 유일하게 정상적인 신초가 재분화 되었고, 이 때 신초는 캘루스로부터 형성된 마디구조에서 발달하였으며 신초의 재분화율은 24.4%였다.
후속연구
- 2016)의 재료로 다시 활용할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구결과는 증식시 이용 가능한 절편체의 부위를 확대함에 따라 희귀 유전자원인 갯봄맞이 기내 증식 효율 향상에 기여할 수 있을 것이다.
- (2016)의 연구에서 절편으로 활용한 마디와 더불어 버려졌던 뿌리와 잎 절편으로부터 캘루스를 유도･증식 한 후 이로부터 식물체를 재분화 시키는 일련의 배양조건을 구명하는데 있다. 본 연구를 통해 얻을 수 있는 캘루스로부터 재분화된 유식물체는 기내증식(Bae et al. 2016)의 재료로 다시 활용할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구결과는 증식시 이용 가능한 절편체의 부위를 확대함에 따라 희귀 유전자원인 갯봄맞이 기내 증식 효율 향상에 기여할 수 있을 것이다.
- 기외 순화시킨 유식물체는 내륙 자연 환경하에서 성숙식물체로 생육하였으며 이듬 해 4월에 개화하였다. 본 연구의 결과는 Bae et al. (2016)이 제안한 마디배양 프로토콜과 통합하여 운용될 수 있고, 통합된 프로토콜은 갯봄맞이의 기내 번식 시스템으로서 갯봄맞이 자생지 복원에 기여할 수 있을 것이다.
- 유식물체의 정단부와 마디를 분할한 후 모두를 BA 0.5mg/L와 IAA 0.5mg/L가 혼용 첨가된 MS배지에 치상하여 다신초를 유도하였을 때 Bae et al. (2016)의 결과와 일치하는 마디당 신초 수, 신초의 평균 초장 및 발근 양상을 나타냄으로써(자료 미제시) ‘PT’ 캘루스 배양에서 유래한 유식물체도 마디배양을 위한 효과적 재료로 활용될 수 있고 본 연구를 통해 얻어진 일련의 결과는 기 보고된 마디배양 체계에 통합시킬 수 있음이 확인되었다.
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