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문제 정의
- 하지만 실제로 각 질환마다 적용할 수 있고 완벽한 시너지효과를 보이는 블랜딩 오일의 과학적 증거들이 불충분하다[19]. 따라서, 본 연구에서는 화농성질환과 병독성질환 비뇨기계통 감염에 나올 수 있는 병원성세균을 대상으로 천연 허브 오일 중에 비교적 많이 알려져 있는 오일인 라벤더(lavender), 티트리(tea tree), 로즈마리(rosemary), 멜리사(melisa)오일 4종류의 단일오일과 티트리와 로즈마리, 멜리사를 블렌딩하였을 때 실제로 항균력의 상승효과를 연구하였다.
- 식물로부터 유래되는 휘발성 유기 화합물인 에센셜 오일은 인체에 약리효과를 나타낸다고 알려져 있다. 본 연구에서는 화농성 질환과 병독성 질환 비뇨기계통 감염에 나올 수 있는 병원성 세균 Staphylococcus aureus (그람양성알균), Escherichia coli (그람음성막대균), Pseudomonas aeruginosa (그람음성막대균, 극성단모균)을 대상으로 천연 허브 오일 중에 비교적 많이 알려져 있는 라벤더(lavender), 티트리(tea tree), 로즈마리(rosemary), 멜리사(melisa) 4종류의 단일 오일과 비교해, 티트리와 로즈마리, 멜리사를 블렌딩하였을 때 항균력이 상승되는 효과가 있는지 연구하였다. 그 결과 디스크 확산법에서 블렌딩 오일(티트리, 로즈마리, 멜리사)의 경우 단독의 허브오일보다 S.
제안 방법
- 18∼24시간 배양 후 디스크 주위의 억제대 직경(mm)을 측정하였다.
- 862 μg/mL인 항균제 분말을 사용하여 역가가 1,280 µg/mL인 표준용액 1 mL을 만들 때의 식을 이용하여 Oxacillin 분말 0.00148 g와 증류수 900 μL와 함께 희석하여 첫 번째 웰에 최종농도는 128 μg/mL부터 2배 계단희석 되었다.
- CLSI 가이드라인 M07-A10 [21]에 따라 대상균주를 Mueller Hinton agar에 직접 제조하여 계대 한 후37°C 배양기(Vision scientific, VS1203P1, Daejeon, Korea)에서 18∼24시간 동안 배양 한 후 집락을 취하여 Mueller Hinton broth 2 mL에 현탁시킨 다음 1.5×108cell/mL가 되는 0.5 MacFatland 표준 값을 densicheck 탁도계(bioMerieux, Marcy L'Etoile, France)로 측정 한 후 Mueller Hinton agar 에 멸균된 면봉으로 고루 분주 하였다.
- CLSI 가이드라인 M07-A10 [21]에 따라 배양된 각 균주의 단일 colony를 Mueller Hinton broth 2 mL에 현탁시킨 다음 1.5 × 108cell/mL가 되는 0.5 MacFarland 표준값을 densicheck 탁도계(bioMerieux, Marcy L'Etoile, France)로 측정 한 후 실험균주를 1/10 씩 계단희석 하여 0.5×105cell/mL로 사용하였다.
- MIC는 그람음성균은 E. coli, P. aeruginosa, 그람양성균은 S. aureus에 대한 티트리, 로즈마리, 멜리사, 라벤더, 블렌딩(티트리, 로즈마리, 멜리사)의 최소억제농도를 알아보기 위하여 허브오일의 농도는 각각 0.0, 0.15, 0.3, 0.625, 1.25, 2.5, 5%로 계단희석 하였으며, 대조군으로 그람양성균에는 Oxacillin, 그람음성균에는 Ciprofloxacin으로 실험하였다. MIC에 의한 항균력 결과는 Table 2와 같이 블렌딩오일의 항균효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
- 각각의 허브오일 5종류를 멸균된 6 mm 종이디스크를 멸균된 페트리디쉬에 세 개씩 담은 다음 수증기추출법으로 추출한 100% 허브 오일을 각 10 μL 씩 분주한 뒤 15분간 흡수시킨 후 또 10 μL씩 분주한 후 1시간을 건조시킨 후 Mueller Hinton agar에 멸균된 핀셋으로 가볍게 올려 놓은 후 살짝 눌러준 후 배지 뚜껑을 밑으로 하여 산소성 배양기에서 35°C로 18∼24시간 배양을 하였다.
- 균주 부유액 100 μL 씩을 96 well plate에 분주하고 희석된 에센셜 오일은 100 μL 를 혼합한 후 계단희석을 하였다.
- 에센셜 오일 100 μL 와 멸균된 증류수 900 μL를 Vortex mixer를 이용하여 혼합하여 사용하였다.
- 이때 총 분주량은 20 μL가 되며, 대조를 위해 항균제디스크 Oxacillin 10 μg (Bectone dickinson, Sensi-DISC, USA)와 Ciprofloxacin 5 μg (Bectone dickinson, Sensi-DISC, USA) 디스크를 동시에 시행하였다.
대상 데이터
- Ciprofloxacin은 0.1 N NaOH와 멸균된 증류수를 1:1 희석한 용액에 효력이 980 μg/mL인 항균제 분말을 사용하여 역가가 1,280 μg/mL인 표준용액 1 mL 만들 때 Ciprofloxacin 파우더를 0.0013g을 희석하여 사용하였다.
- Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli(ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 균 3종류를 tryptic soy broth에 접종 후 사용하여 산소성 배양기(Vision scientific, VS1203P1, Daejeon, Korea)에서 37°C로 18∼24시간 배양을 하였다.
- 오일의 추출은 수증기 증류(steam distillation) 법으로 추출하였으며, 티트리(teetree), 로즈마리(rosemary), 멜리사(melisa), 라벤더(lavender)와 티트리:로즈마리:멜리사(TRM)를 1:1:1로 블렌딩한 오일 5종류를 사용하였다[20]. 오일은 원광대학교 해부학교실로부터 제공받아 사용하였다.
- 오일의 추출은 수증기 증류(steam distillation) 법으로 추출하였으며, 티트리(teetree), 로즈마리(rosemary), 멜리사(melisa), 라벤더(lavender)와 티트리:로즈마리:멜리사(TRM)를 1:1:1로 블렌딩한 오일 5종류를 사용하였다[20]. 오일은 원광대학교 해부학교실로부터 제공받아 사용하였다.
성능/효과
- CLSI 가이드라인 M100-S22 [18]에 따라 그람양성알균에 사용되는 oxacillin 최소억제농도는 S. aureus (ATCC 25923) 그람양성균주는0.25 µg/mL 가 나와 CLSI 가이드라인에 제시하는 범위인 0.12∼0.5 µg/mL 안에들어가 검사의 정도관리를 확인하였으며, Escherichia coli(ATCC 25922)와 P. aeruginosa (ATCC 27853) 그람음성막대균도 ciprofloxacin 최소억제농도를 측정한 결과 균주에 따라 각각 0.008, 0.25 µg/mL 억제농도를 나타내어 CLSI 가이드라인에 제시하는 범위인 0.004∼0.015 µg/mL과 0.25∼2 µg/mL 안에 들어가 검사의 정도관리를 확인하였다.
- CLSI 가이드라인 M100-S22[22]에 따라 그람양성알균에 사용되는 oxacillin 1 µg 디스크의 억제대를 측정한 결과 S. aureus (ATCC 25923) 그람양성균주는 22 mm가 나와 CLSI 가이드라인에 제시하는 범위인 18∼24 mm 안에 들어가 검사의 정도관리를 확인하였으며, Escherichia coli (ATCC 25922)와 P. aeruginosa (ATCC 27853) 그람음성막대균도 ciprofloxacin 5 µg 디스크의 억제대를 측정한 결과 균주에 따라 각각 39, 32 mm 억제대를 나타내어 CLSI 가이드라인에 제시하는 범위인 30∼40 mm 과 25∼33 mm 안에 들어가 검사의 정도관리를 확인하였다(Figure 1∼3).
- Table 2의 결과로 Oxacillin 10 µg/mL 와 비슷한 항균효과를 낸 허브오일은 티트리와 로즈마리로 확인되었으며, 특히 블렌딩 오일(티트리, 로즈마리, 멜리사)은 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 허브의 블렌딩을 활용하면 시너지효과를 발휘할 수 있음을 입증하였다.
- 각 에센셜 오일의 디스크 확산법에 의한 항균력 결과는 Table 1과 같은 억제대 지름을 나타내었으며, 티트리와 블렌딩오일의 항균효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 이 중 티트리는 가장 우수한 항균력을 나타내어 S.
- 본 연구에서는 화농성 질환과 병독성 질환 비뇨기계통 감염에 나올 수 있는 병원성 세균 Staphylococcus aureus (그람양성알균), Escherichia coli (그람음성막대균), Pseudomonas aeruginosa (그람음성막대균, 극성단모균)을 대상으로 천연 허브 오일 중에 비교적 많이 알려져 있는 라벤더(lavender), 티트리(tea tree), 로즈마리(rosemary), 멜리사(melisa) 4종류의 단일 오일과 비교해, 티트리와 로즈마리, 멜리사를 블렌딩하였을 때 항균력이 상승되는 효과가 있는지 연구하였다. 그 결과 디스크 확산법에서 블렌딩 오일(티트리, 로즈마리, 멜리사)의 경우 단독의 허브오일보다 S. aureus에서18 mm, E. coli 에서 22 mm 와 P. aeruginosa는13 mm의 우수한 항균능력을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 블렌딩 오일의 경우 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentrations, MIC) 분석에서 S.
- 3125%로 9배의 계단희석차이가 나타나 확실한 증진효과를 입증하였다. 그러므로, 스크리닝 방법으로 사용된 디스크법은 에센셜오일의 접종과 기술접근의 차이가 있어 오차가 있을 수 있다고 생각되지만, MIC은 균주부유액에 직접 에센셜오일을 희석하는 방법에서 정량이 가능하고 신빙도가 높다고 할 수 있다. 항균효과 결과를 그람양성균과 음성균으로 구별해보면, 세균의 구조차이는 있어 항균효과의 차이를 예상할 수 있겠지만, Table 2의 결과와 같이 음성균인 E.
- 25%에서 성장억제효과가 확인되었다. 따라서 본 실험에서는 블렌딩 오일이 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 단독의 허브오일보다 블렌딩 오일이 우수한 항균력을 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 허브의 블렌딩을 활용하면 다제 내성균에 대한 항균시너지효과를 발휘할 수 있음을 입증했을 뿐만 아니라 향후 천연보존제와 건강기능성 식품 및 화장품에 활용 가능성을 기대해본다.
- 그러나 본 실험은 누적된 항균제가 아닌 정제된 에센션오일의 사용으로 천연물의 효과에 대한 결과해석이 표준화 되지 않은 접종준비와 기술접근, 접종크기, 성장배지, 배양조건 및 최종적인 해석이 어렵다고 알려져 있으며, 디스크 법은 주로 간단하고 저렴한 비용의 장점으로 식물추출물, 에센셜오일 및 기타 약제의 항균력을 보기위한 예비시험으로 많이 사용된다[34]. 본 실험결과에서 디스크확산법은 티트리가 조금 더 우수한 결과를 보였지만, 그에 반해 MIC 값은 비록 S. aureus 와 P. aeruginosa 에서는 큰 차이가 없었지만, E. coli 의 경우 티트리는 2.5%로 측정되었으나 블렌딩오일에서는 0.3125%로 9배의 계단희석차이가 나타나 확실한 증진효과를 입증하였다. 그러므로, 스크리닝 방법으로 사용된 디스크법은 에센셜오일의 접종과 기술접근의 차이가 있어 오차가 있을 수 있다고 생각되지만, MIC은 균주부유액에 직접 에센셜오일을 희석하는 방법에서 정량이 가능하고 신빙도가 높다고 할 수 있다.
- coli 균에서는 9 mm로 나타났다. 본 연구의 결과에도 Table 2와 같이 로즈마리와 라벤더가 항균력이 좋은 것은 일치하였지만, 원내감염균이며, 창상감염에 주요원인균인 P. aeruginosa에는 항균효과가 없었다. Table 2의 결과로 Oxacillin 10 µg/mL 와 비슷한 항균효과를 낸 허브오일은 티트리와 로즈마리로 확인되었으며, 특히 블렌딩 오일(티트리, 로즈마리, 멜리사)은 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 허브의 블렌딩을 활용하면 시너지효과를 발휘할 수 있음을 입증하였다.
- 블렌딩 오일은 S. aureus, E. coli, P. aeruginosa 균주에서 각각 0.3125, 0.3125, 1.25%에서 최소억제농도을 나타내었고, 티트리 오일은 균에 따라 각각 0.3125, 2.5, 1.25%가 측정되었다.
- aeruginosa는13 mm의 우수한 항균능력을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 블렌딩 오일의 경우 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentrations, MIC) 분석에서 S. aureus, E. coli 에서는 0.3125%에서, P. aeruginosa는 1.25%에서 성장억제효과가 확인되었다. 따라서 본 실험에서는 블렌딩 오일이 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 단독의 허브오일보다 블렌딩 오일이 우수한 항균력을 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 각 에센셜 오일의 디스크 확산법에 의한 항균력 결과는 Table 1과 같은 억제대 지름을 나타내었으며, 티트리와 블렌딩오일의 항균효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 이 중 티트리는 가장 우수한 항균력을 나타내어 S. aureus, E. coli, P. aeruginosa 균주에서 각각 21, 25, 13 mm의 억제대가 측정되었고, 블랜딩 오일은 균에 따라 각각 18, 22, 13 mm가 측정되었다. 멜리사는 균에 따라 각각 14, 21, 9 mm가 측정되었고, 로즈마리는 균에 따라 각각 6, 20, 6 mm의 억제대가 나타났다.
- 그러므로, 스크리닝 방법으로 사용된 디스크법은 에센셜오일의 접종과 기술접근의 차이가 있어 오차가 있을 수 있다고 생각되지만, MIC은 균주부유액에 직접 에센셜오일을 희석하는 방법에서 정량이 가능하고 신빙도가 높다고 할 수 있다. 항균효과 결과를 그람양성균과 음성균으로 구별해보면, 세균의 구조차이는 있어 항균효과의 차이를 예상할 수 있겠지만, Table 2의 결과와 같이 음성균인 E. coli는 양성균인 S. aureus 와 디스크 확산법에서는 큰차이가 나지 않으나 P. aeruginosa에서는 로즈마리와 라벤더가 항균효과가 없는 것으로 나와 양성균과 음성균의 차이에 따른 항균력의 차이는 논하기가 힘들고 균종별 항균력의 차이가 있는 것으로 보인다. 허브오일의 항균활성은 Nguefack등 [35]에 의하면 그람음성균의 세포막의 침투성증가와 ATP감소로 LPS방출로 사멸하거나 Bouhdid 등[36]은 칼륨의 유출로 세포손상이 오고 세포벽의 구조와 성분의 변화가 사멸을 유도한다고 알려져 있으나 앞으로 좀 더 많은 허브오일의 살균메커니즘에 관한 연구가 필요하다고 사료된다.
후속연구
- 따라서 본 실험에서는 블렌딩 오일이 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 단독의 허브오일보다 블렌딩 오일이 우수한 항균력을 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 허브의 블렌딩을 활용하면 다제 내성균에 대한 항균시너지효과를 발휘할 수 있음을 입증했을 뿐만 아니라 향후 천연보존제와 건강기능성 식품 및 화장품에 활용 가능성을 기대해본다.
- 시료의 추출방법에서도 수증기증류법으로 추출하였지만 천연물로부터 정유를 추출하는 방법 중에 성분의 파괴없이 고순도 정유추출법인 초임계 추출법으로 사용하였다면, 더 좋은 항균효과가 있을 거라 예상되고 추출방법별 항균효과의 비교도 앞으로 연구가 필요하다고 할 수 있다. 따라서, 본 연구의 결과로 블렌딩한 허브오일의 시너지효과를 입증하였고, 단독으로는 로즈마리와 티트리가 항균효과가 좋았으며, 향후 천연보존제 뿐만 건강기능성 식품이나 화장품 등에 활용가능 할 것으로 사료된다.
- Table 2의 결과로 Oxacillin 10 µg/mL 와 비슷한 항균효과를 낸 허브오일은 티트리와 로즈마리로 확인되었으며, 특히 블렌딩 오일(티트리, 로즈마리, 멜리사)은 Oxacillin과 로즈마리, 티트리보다 항균효과가 우수한 것으로 증명되어 허브의 블렌딩을 활용하면 시너지효과를 발휘할 수 있음을 입증하였다. 본 연구에서는 항균효과만 관찰하였지만, 차후 건강식품과 식품첨가물 등의 활용을 목적으로 항산화효과를 입증하는 것도 필요하다고 할 수 있다. 본 연구에서 디스크확산법의 경우 1940년부터 발전되었으며[31], 많은 임상검사실에서 박테리아와 진균의 항균제 감수검사에 사용되고 있다[17,18].
- 그람음성균에서 디스크확산법과 MIC법의 다소 항균력의 차이를 보이는 것은 허브오일을 10배 희석후 MIC를 시행하여 결과가 차이가 있는 것으로 사료된다. 시료의 추출방법에서도 수증기증류법으로 추출하였지만 천연물로부터 정유를 추출하는 방법 중에 성분의 파괴없이 고순도 정유추출법인 초임계 추출법으로 사용하였다면, 더 좋은 항균효과가 있을 거라 예상되고 추출방법별 항균효과의 비교도 앞으로 연구가 필요하다고 할 수 있다. 따라서, 본 연구의 결과로 블렌딩한 허브오일의 시너지효과를 입증하였고, 단독으로는 로즈마리와 티트리가 항균효과가 좋았으며, 향후 천연보존제 뿐만 건강기능성 식품이나 화장품 등에 활용가능 할 것으로 사료된다.
- aeruginosa에서는 로즈마리와 라벤더가 항균효과가 없는 것으로 나와 양성균과 음성균의 차이에 따른 항균력의 차이는 논하기가 힘들고 균종별 항균력의 차이가 있는 것으로 보인다. 허브오일의 항균활성은 Nguefack등 [35]에 의하면 그람음성균의 세포막의 침투성증가와 ATP감소로 LPS방출로 사멸하거나 Bouhdid 등[36]은 칼륨의 유출로 세포손상이 오고 세포벽의 구조와 성분의 변화가 사멸을 유도한다고 알려져 있으나 앞으로 좀 더 많은 허브오일의 살균메커니즘에 관한 연구가 필요하다고 사료된다. 그람음성균에서 디스크확산법과 MIC법의 다소 항균력의 차이를 보이는 것은 허브오일을 10배 희석후 MIC를 시행하여 결과가 차이가 있는 것으로 사료된다.
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