선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 10-12) 본 연구에서는 이전 연구에서 뛰어난 항바이러스 효과를 나타낸 물질들에 대해 CVB3에 대한 증식억제 효과 실험을 수행하고 그 결과 가장 우수한 증식 억제효과를 나타낸 kaempferol의 대표적인 enterovirus로 심근염을 일으키는 CVB3에 대한 증식 억제 효과와 enterovirus 증식과 관련된 세포 신호 조절을 확인하고자 하였다.
- 이 연구를 통해 식물추출물의 단일물질을 분리하여 항바이러스 효과를 실험하여 새로운 항 enterovirus 치료보조제로의 개발 가능성을 실험하였다. 우리나라는 예전부터 다양한 식물을 병의 치료제로 사용하여 왔으며 이러한 식물 약제에 대한 정보와 지식이 잘 정립되어 있다.
제안 방법
- 10) 바이러스 농도확인을 위해 바이러스에 감염된 세포의 상등액을 serial dilution하여 준비하고 HeLa 세포가 배양된 6-well plate에 30분간 감염시킨 후 3% Difco agar/DMEM1:1로 혼합하여 1.5 ml로 덮어주고 37oC CO2 배양기에서 배양하여 바이러스 감염에 의한 세포사멸을 확인하고 plaque 숫자를 세어 plaque forming unit(PFU) assay로 바이러스 농도를 측정하였다. HeLa cell은 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle medium(DMEM)에서 배양하였으며 4-5일마다 계대 배양하여 새로운 세포를 준비하였다.
- CVB3에 대한 증식억제 효능 검증을 위해 HeLa 세포에 단일추출물들을 100 μg/ml부터 serial dilution하고 농도별로 바이러스 104 PFU와 함께 처리하여 효능을 검증하고 이중 항바이러스 효능이 뛰어난 kaempferol을 선정하였다(supplementdata).
- Coxsackievirus 복제 RNA 검출 − 단일 양성 가닥 RNA 유전자를 가지고 있는 CVB3의 유전자 증폭 확인을 위해 바이러스와 단일 추출물이 처리된 세포에서 TRIzol reagent(Invitrogen, USA)로 RNA를 추출하고 정량한다.
- Coxsackievirus 증식 억제 물질 선별 − 천연물 추출물에서 분리한 단일 물질들의 항바이러스 효능을 HeLa 세포의 생존 실험을 사용하여 CVB3에 대한 증식 억제 물질을 선별하였다.
- Coxsackievirus 증식억제 단일추출물 선정 − HeLa 세포의 생존실험을 통해 CVB3에 대한 항바이러스 효과를 검증하였다.
- Coxsackievirus와 세포배양 − Coxsackievirus 농도는 이전의 논문에서 묘사 한 것과 같이 HeLa cell에서 plague forming unit(PFU) assay를 통해 결정하고 실험에 사용하였다.
- HeLa 세포를 96well-plate에 5×104 숫자로 배양하고 104 PFU/ml의 CVB3를 30분간 감염시키고 5% FBSDMEM에 1 mg/ml부터 1 ng/ml까지 serial dilution 한 다양한 단일추출물질을 처리하였다.
- 그러므로 kaempferol의 CVB3 증식억제 활성과 작용점 연구를 위해 바이러스 유전자 증폭 억제 검증은 필수이다. Kaempferol을 CVB3와 함께 10시간 동안 HeLa 세포에 처리 후 total RNA를 추출하고 바이러스의 유전자를 reverse transcription(RT)을 수행하여 cDNA로 합성하였다. 바이러스의 positive와 negative strand RNA의 증폭을 합성된 cDNA PCR을 통해 검증하였다.
- 이전의 연구에서 MAPK 세포신호는 바이러스의 초기 감염과 증식 시기에 가장 중요한 세포 신호임이 밝혀졌으며 이러한 MAPK 세포신호의 활성억제는 세포의 활성은 물론 enterovirus의 증식을 억제한다. Kaempferol의 CVB3 증식억제 메커니즘 규명을 위해 바이러스 감염 후 kaempferol 처리에 따른 대표적인 MAPK인 ERK1/2와 이와 상호관계를 가지고 autophagy를 형성하는 mTOR의 활성변화를 관찰하였다. ERK의 활성을 나타내는 인산화 ERK(pERK)는 kaempferol 100 μg/ml 처리에 50% 이상 유의한 감소를 나타냈으며 mTOR의 인산화(pmTOR)는 75% 이상 유의하게 감소했다(Fig.
- 전기 영동 된 Gel의 단백질을 Hybond-ECL nitrocellulose membrane으로 transfer하였다. Membrane은 5% skim milk solution으로 block하고 anti-enterovirus VP1, eIF4G1, pAKT(s473), AKT, pERK, ERK, GAPDH antibodies(Cell signaling, CA, USA)로 4oC에서 18시간 반응한 후 확인하였다.
- 바이러스의 양성 가닥 증폭을 위해 VP1-antisense primer(5'-CACCGGATGGCCAATCCA-3')와 음성 가닥 증폭을 위해 VP1-sense primer(5'-GCGAAGAGTCTATTGAGCTA-3')를 사용하여 RT 반응을 수행 후 두 primer를 사용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 95oC 5분 처리 후 95oC 1분, 55oC 1분, 72oC 1분을 30회 반복하고 72oC 8분 반응하여 수행하였다. PCR 반응물은 1.5% agarose gel에 100 vol로 20분간 전기 영동하여 확인하였다.
- 분리 정제된 Kaempferol은 100 μg/ml에서 100 ng/ml까지 serial dilution하여 처리하였다. 바이러스와 물질처리 후 10시간까지 세포의 바이러스 감염으로 인한 괴사발생을 관찰하고 바이러스만을 감염시킨 세포(positive)가 50% 이상 감염되었을 시점에 전체 단백질을 추출하여 western blot을 수행하였다. Kaempferol의 처리는 CVB3 막단백질 VP1의 증가와 바이러스 증식으로 발현된 바이러스 protease 2A에 의한 전사개시인자 eIF4G1의 절단을 높은 투여 농도(100 μg/ml)에서 유의하게 감소시켰다(Fig.
- Kaempferol을 CVB3와 함께 10시간 동안 HeLa 세포에 처리 후 total RNA를 추출하고 바이러스의 유전자를 reverse transcription(RT)을 수행하여 cDNA로 합성하였다. 바이러스의 positive와 negative strand RNA의 증폭을 합성된 cDNA PCR을 통해 검증하였다. Kaempferol 100 μg/ml 처리는 CVB3 바이러스의 positive와 negative strand 유전자의 증폭을 강력하게 억제하여 뛰어난 바이러스 증식 억제 활성을 나타냈다(Fig.
- 바이러스의 양성 가닥 증폭을 위해 VP1-antisense primer(5'-CACCGGATGGCCAATCCA-3')와 음성 가닥 증폭을 위해 VP1-sense primer(5'-GCGAAGAGTCTATTGAGCTA-3')를 사용하여 RT 반응을 수행 후 두 primer를 사용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 95oC 5분 처리 후 95oC 1분, 55oC 1분, 72oC 1분을 30회 반복하고 72oC 8분 반응하여 수행하였다.
- 분리된 분획물들을 소량 채취하여 액체 크로마토그래피/질량분석기(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) 분석한 후, kaempferol 함량이 가장 많은 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피(Phenomenex Luna C18(2), 250×100mm, 2.0 ml/min, 5 μm, UV=254 nm)를 실시하여 분리하였다.
- 20) 세포 증식 검출 시약인 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 8 μl를 감염 24시간 후에 넣고 2시간 더 배양한다. 세포의 생존에 따라 변화되는 세포배양액의 변화를 microplate reader(Molecular device, USA)를사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존을 확인 천연물의 항바이러스 효능을 검증하였다.
- 추출된 RNA 1 μg을 주형으로 Reverse-transcription(RT) kit (NEX diagnosis, KOR)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.
- (4 g)을 넣고 하루 동안 유지하였다. 침전물을 제외한 추출물을 농축한 뒤, 물과 희석하여 헥산, 에틸아세테이트 순으로 분획을 진행하였고 이 중 에틸아세테이트 층을 실리카젤 컬럼 크로마토그래(헥산: 에틸아세테이트, 100% 헥세인 으로부터 100% 에틸아세테이트)를 실시하였다. 분리된 분획물들을 소량 채취하여 액체 크로마토그래피/질량분석기(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) 분석한 후, kaempferol 함량이 가장 많은 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피(Phenomenex Luna C18(2), 250×100mm, 2.
데이터처리
- 결과의 통계분석 − 모든 결과는 3회 이상의 반복 실험을 통해 얻은 결과를 mean±SD으로 나타냈다.
- 결과의 통계분석 − 모든 결과는 3회 이상의 반복 실험을 통해 얻은 결과를 mean±SD으로 나타냈다. 약물처리, 미처리 바이러스 감염 그룹 간의 결과는 student t-test(GraphPadPrism 4.0 for Windows; GraphPad Software, La Jolla, USA)를 사용하여 유의성을 검증하였다. *P<0.
성능/효과
- ERK의 활성을 나타내는 인산화 ERK(pERK)는 kaempferol 100 μg/ml 처리에 50% 이상 유의한 감소를 나타냈으며 mTOR의 인산화(pmTOR)는 75% 이상 유의하게 감소했다(Fig. 4).
- Kaempferol 100 μg/ml 처리는 CVB3 바이러스의 positive와 negative strand 유전자의 증폭을 강력하게 억제하여 뛰어난 바이러스 증식 억제 활성을 나타냈다(Fig. 3).
- Kaempferol이 처리된 HeLa세포 생존율은 바이러스만을 처리한 positive 샘플과 비교하여 100 μg/ml 농도에서 90% 이상의 세포생존을 나타내 뛰어난 항바이러스 효능을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 4). 본 결과를 통해 kaempferol의 MAPK 신호억제 작용이 바이러스 증식조절의 주요 메커니즘임을 확인할 수 있었다. 또한 kaempferol의 mTOR 신호의 억제 효과는 다른 바이러스에 적용할 수 있는 폭넓은 사용 가능성을 보여준 매우 중요한 발견이다.
- 본 연구는 질려자 추출물 단일분리물질 kaempferol의 심근염 유발 enterovirus에 대한 증식억제와 이와 관련된 MAPK 세포신호 억제 활성을 검증하였으며 이에 따른 바이러스 감염 초기 유전자 증폭 억제는 효과적인 바이러스증식 억제 작용이 가능하게 함을 보여주었다. 이러한 결과는 향후 kaempferol의 enterovirus 감염 예방과 치료를 위한 독성이 없는 천연물 약물로의 개발 가능성을 보여주었다.
- 2A). 이를 통해 kaempferol이 CVB3의 증식을 효과적으로 저해하는 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 특히 바이러스의 VP1 막 단백질은 100 μg/ml 투여 시 매우 낮은 농도가 관찰되어 kaempferol의 뛰어난 enterovirus 증식억제 활성을 보였다(Fig.
- 특히 바이러스의 VP1 막 단백질은 100 μg/ml 투여 시 매우 낮은 농도가 관찰되어 kaempferol의 뛰어난 enterovirus 증식억제 활성을 보였다(Fig. 2B).
후속연구
- 본 연구는 질려자 추출물 단일분리물질 kaempferol의 심근염 유발 enterovirus에 대한 증식억제와 이와 관련된 MAPK 세포신호 억제 활성을 검증하였으며 이에 따른 바이러스 감염 초기 유전자 증폭 억제는 효과적인 바이러스증식 억제 작용이 가능하게 함을 보여주었다. 이러한 결과는 향후 kaempferol의 enterovirus 감염 예방과 치료를 위한 독성이 없는 천연물 약물로의 개발 가능성을 보여주었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.