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문제 정의
- 블루베리 듀크 추출물을 제조하고 이 추출물의 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 측정한 후에 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성에 미치는 영향과 선충 세포 내의 활성산소종의 축적 억제 능력을 측정하였다. 또한 juglone으로 유도된 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인하고 이와 관련된 기전 중의 하나로 선충 내의 oxidative stress 저항 단백질의 증가여부를 확인하기 위하여 SOD-3을 포함한 형질전환 선충 CF1553을 이용하여 SOD 발현 증가 여부를 실험하여 몇 가지 지견을 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 저자 등이 블루베리 듀크(Vaccinium corymbosum L., Ericaceae)의 주정 추출물의 항산화 효능을 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) model system을 이용하여 확인해 보고자 실험을 실시하였다. 블루베리 듀크 추출물을 제조하고 이 추출물의 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 측정한 후에 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성에 미치는 영향과 선충 세포 내의 활성산소종의 축적 억제 능력을 측정하였다.
- 형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 − 선충 내에서 oxidative stress에 저항하기 위한 단백질의 증가여부를 확인하기 위해서 SOD 발현 유전자의 증가 여부를 확인하였다.
제안 방법
- Catalase activity는 Aebi의 방법을 응용하여 25 mM H2O2에 시료 50 µL(EDZ 250, 500 µg/mL)를 3분 동안 반응시키고 240 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- DPPH free radical 소거활성 측정9) − 96 well plate에 ethanol로 용해한 시료를 각 농도 별로 조제한 용액에 13 µM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 일정량씩 가하였다.
- − 성장 단계가 동일한 선충을 각각의 농도별 plate에서 배양하였다(EDZ 250, 500 µg/mL). Oxidative stress에 의한 내성은 기존 방법을 약간 변형하여 평가하였으며, 성체가 된 후 7일째에 일시적으로선충을 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate에 옮기고 시간 별로 생존율을 확인하였다.
- 5). SOD 활성은 Ibrahim 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저 10 mM phosphate buffer(pH 8.
- Superoxide 억제 활성10,11) − Riboflavin 유래 Superoxide 억제 활성은 ethanol을 이용하여 농도별로 조제한 시료 50 µL에 2.6 µM Riboflavin, 3 mM Methionine, 75 µM NBT, 0.1 mM EDTA, PBS(pH 7.4)로 이루어진 반응혼합물 250 µL을 첨가하여 5,500 lux, 20±1oC의 light box에 넣고 5분마다 자리를 임의로 바꾸어 주면서 15분 동안 방치한 후 microplate reader를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.
- 성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(2%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
- , Ericaceae)의 주정 추출물의 항산화 효능을 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) model system을 이용하여 확인해 보고자 실험을 실시하였다. 블루베리 듀크 추출물을 제조하고 이 추출물의 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 측정한 후에 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성에 미치는 영향과 선충 세포 내의 활성산소종의 축적 억제 능력을 측정하였다. 또한 juglone으로 유도된 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인하고 이와 관련된 기전 중의 하나로 선충 내의 oxidative stress 저항 단백질의 증가여부를 확인하기 위하여 SOD-3을 포함한 형질전환 선충 CF1553을 이용하여 SOD 발현 증가 여부를 실험하여 몇 가지 지견을 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
- 선충 세포 내 활성산소종(ROS) 분석14) − 세포 내 활성산소종은 2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate(H2DCFDA)를 사용하여 측정하였다.
- 선충에 산화적 스트레스를 유도하기 위해서 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate에서 배양한 대조군 선충의 최고 생존시간은 25시간이었으나, 블루베리 듀크 추출물 250, 500 µg/mL 농도에서 각각 생존시간을 27, 31시간으로 증가시켰다.
- 형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정 − 형질 전환된 선충으로 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553을 농도별로 투여된 배지에 배양하였다. 성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(2%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
- 추출 − 블루베리 듀크 50 g을 주정으로 가끔 진탕하면서 50oC에서 6시간씩 2회 추출하였다.
- 대조약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.
- 항산화 효소 SOD 및 catalase 활성증가 효능 − Xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응 과정 중에 생성되는 superoxide anion을 활용하여 SOD의 활성을 측정하였다.
- 활성 산소종(ROS) 감소 효능 − 블루베리 주정추출물의 농도별 세포 내 활성산소종의 감소 효능을 알아보기 위해 H2DCF-DA와 선충 내부의 활성산소종을 반응시켜 형광을 관찰하였다.
대상 데이터
- Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates.
- 10초간 진탕한 후 25oC에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 블루베리 듀크는 2017년에 순창군에서 재배한 것을 (재)발효미생물산업진흥원의 정성엽 박사가 검증한 후 실험에 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-17-004).
- 예쁜꼬마선충의 배양11) − 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans, wild type)과 Escherichia coli OP50은 차동석교수 (우석대학교 한약학과)로부터 제공받은 것을 사용하였으며, Escherichia coli OP50을 도말한 nematode growth medium(NGM) agar plate에서 배양하였다(20oC).
- 형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정 − 형질 전환된 선충으로 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553을 농도별로 투여된 배지에 배양하였다.
데이터처리
- Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
- Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, and **p<0.01 by one-way ANOVA.
- For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates.
- 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다.
- 통계 분석 − 통계 자료의 값은 평균값±표준오차(mean±S.E.M.)로 표시하였다.
이론/모형
- Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at **p<0.
성능/효과
- 이러한 결과는 블루베리의 주성분으로 알려진 anthocyanin 성분을 비롯한 polyphenol성 화합물들에 의한 효능으로 생각되며 보고된 블부베리 추출물과 anthocyanin 성분의 항산화 효능들과 잘 부합되는 결과로 판단된다.16-19)예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 확인해 본 결과 블루베리 주정 추출물은 농도 의존적으로 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되어 활성산소종에 의해 야기되는 산화적 스트레스로부터 방어하는 기전에 도움이 될 것으로 생각된다.20,21) 또한 선충에 블루베리 듀크 추출물을 처리하고 산화적 스트레스를 야기시키기 위해 juglone을 투여한 후 선충 세포 내 활성산소종 수치의 변화를 확인한 결과 농도 의존적으로 강한 활성산소종 축적 억제 효능을 보여 주었다.
- Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 선충의 블루베리 듀크 추출물 투여군은 SOD의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 블루베리 주정 추출물 500 µg/mL 투여군은 대조군과 비교하여 SOD 활성을 약 9.97% 정도 증가시켰다(*p<0.05).
- Oxidative stress 저항성 증가 효능 − 블루베리 듀크 추출물이 선충의 스트레스 저항성에 미치는 영향은 산화적 스트레스 조건에서 선충의 생존율을 확인하였다.
- SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 블루베리 듀크 추출물을 투여한 선충군이 처리되지 않은 선충군에 비해 상당히 높은 SOD-3::GFP 발현율(18.12%, ***p<0.001)을 보여주었다(Fig. 6).
- 대조군의 평균 생존시간이 15.88±0.9시간었으나 500 µg/mL 농도 처리군은 평균 생존 시간을 20.08±1.2시간으로 26.44%의 생존 시간을 향상시켰다(**p<0.01)(Fig. 5, Table I).
- 블루베리 듀크 주정 추출물은 DPPH radical과, superoxide 소거활성 시험에서 강한 항산화력을 보여 주었으며, 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성이 추출물 투여에 의해 농도 의존적으로 높아졌다. 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 블루베리 추출물 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 예쁜꼬마선충의 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용한 oxidative stress 저항성을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 형광발현 정도를 측정하여 확인하였다.
- 발현강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 블루베리 듀크 주정 추출물은 DPPH radical과, superoxide 소거활성 시험에서 강한 항산화력을 보여 주었으며, 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성이 추출물 투여에 의해 농도 의존적으로 높아졌다. 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 블루베리 추출물 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
- 이와 관련하여 juglone으로 oxidative stress를 발생시킨 선충의 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인한 결과 블루베리 듀크 추출물 처리군이 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하였다. 이를 확인할 수 있는 기전 중의 하나로써, 형질전환된 선충의 하나인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 juglone으로 처리한 oxidative stress 저항성 확인실험에서 저항성을 나타내는 지표인자인 SOD-3::GFP 형광 발현율을 살펴 본 결과 형광 발현율이 농도 의존적으로 증가됨이 관찰되어 oxidative stress에 저항하는 단백질의 발현이 상당히 증가되었음을 확인되었다. 인체 내의 활성산소종은 주로 미토콘드리아에서 생성되며, 스트레스 및 세포 손상 등에 의해서도 생성되어 체내의 항산화제를 소멸시켜 oxidative stress를 야기하며, 노화를 비롯한 각종 암 발생 및 염증 생성 등에 관련성이 있다고 보고되어 있다.
- 20,21) 또한 선충에 블루베리 듀크 추출물을 처리하고 산화적 스트레스를 야기시키기 위해 juglone을 투여한 후 선충 세포 내 활성산소종 수치의 변화를 확인한 결과 농도 의존적으로 강한 활성산소종 축적 억제 효능을 보여 주었다. 이와 관련하여 juglone으로 oxidative stress를 발생시킨 선충의 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인한 결과 블루베리 듀크 추출물 처리군이 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하였다. 이를 확인할 수 있는 기전 중의 하나로써, 형질전환된 선충의 하나인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 juglone으로 처리한 oxidative stress 저항성 확인실험에서 저항성을 나타내는 지표인자인 SOD-3::GFP 형광 발현율을 살펴 본 결과 형광 발현율이 농도 의존적으로 증가됨이 관찰되어 oxidative stress에 저항하는 단백질의 발현이 상당히 증가되었음을 확인되었다.
- 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 블루베리 추출물 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 예쁜꼬마선충의 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용한 oxidative stress 저항성을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 형광발현 정도를 측정하여 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 블루베리 듀크 추출물은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.
- 활성산소종 형광의 감소 폭은 대조군과 비교하여 블루베리 듀크 추출물 500 µg/mL 투여군에서 약 14.27% (**p<0.01)로 관찰되고, 활성산소종을 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 4).
후속연구
- 24-26) 따라서 블루베리 듀크 추출물이 체내의 SOD나 catalase 등의 항산화 효소의 활성을 증가시키고, 활성산소종의 축적을 억제하며 oxidative stress에 대한 저항력을 높여 주는 효능은 노화나 수명연장 및 암이나 염증성 질환 등의 예방 및 치료 등에 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 추측된다. 앞으로 활성물질 분리와 단일 물질 수준에서의 항산화 활성 및 기전 확인이 필요할 것으로 사료된다.
- 이와 관련하여 예쁜꼬마선충의 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용한 oxidative stress 저항성을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 형광발현 정도를 측정하여 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 블루베리 듀크 추출물은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.
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