[논문]Lipopolysaccharide로 유도된 Raw 264.7 cell에서 잣 잎(Koreinsis chinensis L.) 추출물의 Pro-inflammatory 억제 효과

조영제

doi:10.3839/jabc.2017.031

[국내논문] Lipopolysaccharide로 유도된 Raw 264.7 cell에서 잣 잎(Koreinsis chinensis L.) 추출물의 Pro-inflammatory 억제 효과
Inhibitory effect of Koreinsis chinensis leaves extract on proinflammatory responses in lipopolysaccharide-induced Raw 264.7 cells 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.60 no.3, 2017년, pp.191 - 198

조영제 (School of Food science & Biotechnology)

초록
AI-Helper

잣나무 잎 추출물에 대해 염증인자인 hyaluronidase 저해효과를 측정한 결과 ethanol 추출물에서 물추출물에 비해 상대적으로 더 높은 HAase 저해효과를 보여주었으며, $50-200{\mu}g/mL$ phenolic 농도에서 13.2-29.5%의 저해효과를 나타내었다. 잣나무잎 추출물을 Raw 264.7 cell에 농도별로 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 LPS처리군은 LPS 무처리군에 비하여 3배에 가까운 NO발현을 나타내었으며, 농도 의존적으로 NO발현을 억제하였다. LPS에 의해서 생성된 $PGE_2$의 생성억제 효과를 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리농도에서 ethanol 추출물이 26.2%의 저해율을 나타내었다. NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 농도에서 40%의 높은 억제효과를 나타내었으며, 농도 의존적으로 감소하는 경향을 관찰 할 수 있었다. LPS 처리시 또 다른 염증인자인 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리 농도에서 64%의 저해효과를 나타내었다. 잣나무잎 추출물이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성되는 $TNF-{\cdot}$, IL-6의 생성억제 효과를 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리농도에서 각각 61.7, 62%의 저해 효과를 나타내었다. 따라서 잣나무잎 추출물은 염증억제를 위한 천연 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Hyaluronidase inhibitory activity as inflammatory factor of Koreinsis chinensis leaf ethanol extract was showed higher inhibitory activity than water extract. 29.5% inhibitory activity was shown at concentration of $200{\mu}g/mL$ phenolics. Lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 cells were treated with different concentrations ($5-25{\mu}g/mL$) of Koreinsis chinensis leaf extract and the amount of nitric oxide (NO) was determined; LPS-treated cells produced 3 times more NO than non-LPS treated cells. Moreover, the NO production in cells treated with Koreinsis chinensis leaf extract showed inhibitory effect in a concentration-dependent manner. Due to the stimulant-induced NO production is regulated by the inducible nitric oxide synthase (iNOS), we determined the iNOS protein level to elucidate the mechanism by which the NO production was inhibited. It was reduced by 40% with a Koreinsis chinensis leaf extract concentration of $25{\mu}g/mL$ and identified iNOS inhibition in dose-dependent manner. The prostaglandin $E_2$ production in cells treated with Koreinsis chinensis leaf extract was reduced by 26.2% at concentration of $25{\mu}g/mL$. The protein expression of cyclooxygenase-2 in LPS-treated Raw 264.7 cells was inhibited by 64% at $25{\mu}g/mL$ of Koreinsis chinensis leaf extract. Koreinsis chinensis leaf extract had a concentration-dependent inhibitory effect on the production of tumor necrosis factor-${\alpha}$ and interleukin-6 as pro-inflammatory cytokine in LPS-treated Raw 264.7 cells at $25{\mu}g/mL$ of Koreinsis chinensis leaf extract. Their levels were decreased by 61.7 and 62% respectively.

Keyword

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

따라서 본 연구에서는 국내에서 발생되어 수확되지 않고 방치되어 버려지는 임산폐자원인 잣나무(Pinus koraiensis) 잎 추출물에서 염증억제효과를 가지는 물질이 있음을 확인하고, 추출물의 염증 억제 효과를 macrophage cell 라인인 Raw cell을 이용하여 항염증 효과를 검정하기 위하여 세포내의 단백질의 변화를 Western blotting을 통하여 NO, PGE2, iNOS, COX-2 등의 protein expression억제효과와 proinflammatory cytokine의 억제 효과를 확인하여 약리성 식품 소재(medicinal food resources)로 활용하고자 하였다.

제안 방법

NO 측정은 cell의 supernatant에서의 NO의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태는 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였다.

대상 데이터

Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하였다.세포배양은 10% fetal bovine serum (HyClone, GE Healthcare Life Science, Chicago, IL, USA), 100 U/mL penicillin 및100 μg/mL streptomycin을 혼합한 배지를 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium으로 37 °C, 5% CO₂ incubator에서 72시간 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 23×10⁶/mL정도가 되게 계대 배양하여 5% CO₂ 조건으로 cell 상태를 유지하였다.
본 실험에 사용된 시료는 경북 영천지역에서 재배되고 있는 잣나무로부터 2015년에 채취하여 45 ℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh 분말로 만들어 4 °C 냉장 보관하며 시료로 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 실험결과는 평균±표준오차로 표기하였다. 분석에 영향을 미치는 모든 변수들은 SAS program (SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 처리 하였다(Statistical Analysis System Institute 2001).

이론/모형

세포 독성 측정은 Carmichael (1987)의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.

성능/효과

5%의 저해효과를 나타내어 ethanol 추출물에서 상대적으로 더 높은 HAase 저해효과를 보여주었다. 식물소재 중에서 오가피, 우슬, 석창포, 당귀,해동피, 갈근, 복분자 등의 추출물에서 10% 정도의 HAase저해활성을 보고한 문헌(Lee 2001)과 비교하면 잣잎 추출물의 항염증 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 잣잎 추출물은 염증 유발 요소인 HAase 저해로 인한 항염증, 아토피 억제효과를 활용하는 제품에 적용할 수 있을 것이라 판단되었다.
식물소재 중에서 오가피, 우슬, 석창포, 당귀,해동피, 갈근, 복분자 등의 추출물에서 10% 정도의 HAase저해활성을 보고한 문헌(Lee 2001)과 비교하면 잣잎 추출물의 항염증 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 잣잎 추출물은 염증 유발 요소인 HAase 저해로 인한 항염증, 아토피 억제효과를 활용하는 제품에 적용할 수 있을 것이라 판단되었다.
Salidroside 추출물이 iNOS 저해 활성 측정에서 30%의 활성을 나타내었다는 Won 등(2008)의 보고보다 잣나무잎 ethanol 추출물이 저해 효과가 높았다. 따라서 잣잎 ethanol 추출물은 LPS에 의해 유도된 iNOS protein의 전사를 저해하여 염증반응 억제를 유도하는 물질임을 확인 할 수 있었다.
7 세포에서 높은 염증반응 억제 효과를 기대할 수 있었다. 따라서 잣나무 잎 ethanol 추출물은 염증억제를 위한 천연 기능성 소재로 활용이 가능할것으로 판단되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	잣나무에 함유된 천연물은 무엇이 있는가?	잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로, Lee 등(2003)은 잣나무에 함유된 천연물로 5-hydroxy-7-methoxyflavone, chrysin, pinocembrin, galangin, pinosylvin, 3-hydroxy-5-methoxystilbene 등을 보고하였고, Bae등(2003)과 Cuyckens와 Claeys (2004)는 잣나무 잎의 성분으로는 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, scopoletin, (+)-catechin 등의 물질을 분리 동정하였다. 또한 Kim 등(2010)은 잣나무 잎에 존재하는 항균물질이 astragalin과 juglanin임을 보고하였다.
	macrophage가 염증을 일으키는 기전은 무엇인가?	생체의 면역기구로 골수에서 생산되는 탐식세포인 macrophage는 체내에 들어온 이물질을 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포인데, 미량의 그람 음성균의 외막 구성성분인 lipopolysaccharide에 의해 활성화되어 cytokine, 활성산소, nitric oxide (NO) 등을 생산, 방출하게 된다(Oshima와 Bartsch 1994; Gross와 Wolin 1995; Kroncke 등, 1998).특히, 대식세포에서 lipopolysaccharide와 같은 자극에 의해 염증 반응의 전사인자인 nuclear factor-κB를 활성화시켜 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 단백질을 발현시켜 과량의 NO와 prostaglandin E2를 생성하여 염증을 일으킨다(Stuehr 1999; So 등, 2004; Nirupama 등, 2005). 이때 interleukin-1β, IL-6 그리고 tumor necrosis factor와 같은 proinflammatory cytokine을 분비하여 염증반응에도 관여하게 된다(Naoko 등, 2005; Nirupama 등, 2005).
	macrophage는 무엇인가?	생체의 면역기구로 골수에서 생산되는 탐식세포인 macrophage는 체내에 들어온 이물질을 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포인데, 미량의 그람 음성균의 외막 구성성분인 lipopolysaccharide에 의해 활성화되어 cytokine, 활성산소, nitric oxide (NO) 등을 생산, 방출하게 된다(Oshima와 Bartsch 1994; Gross와 Wolin 1995; Kroncke 등, 1998).특히, 대식세포에서 lipopolysaccharide와 같은 자극에 의해 염증 반응의 전사인자인 nuclear factor-κB를 활성화시켜 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 단백질을 발현시켜 과량의 NO와 prostaglandin E2를 생성하여 염증을 일으킨다(Stuehr 1999; So 등, 2004; Nirupama 등, 2005).

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