[논문]Lipopolysaccharide로 유도된 Raw 264.7 cell에서 잣 잎(Koreinsis chinensis L.) 추출물의 Pro-inflammatory 억제 효과

조영제

doi:10.3839/jabc.2017.031

[국내논문] Lipopolysaccharide로 유도된 Raw 264.7 cell에서 잣 잎(Koreinsis chinensis L.) 추출물의 Pro-inflammatory 억제 효과
Inhibitory effect of Koreinsis chinensis leaves extract on proinflammatory responses in lipopolysaccharide-induced Raw 264.7 cells 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.60 no.3, 2017년, pp.191 - 198

조영제 (School of Food science & Biotechnology)

초록
AI-Helper

잣나무 잎 추출물에 대해 염증인자인 hyaluronidase 저해효과를 측정한 결과 ethanol 추출물에서 물추출물에 비해 상대적으로 더 높은 HAase 저해효과를 보여주었으며, $50-200{\mu}g/mL$ phenolic 농도에서 13.2-29.5%의 저해효과를 나타내었다. 잣나무잎 추출물을 Raw 264.7 cell에 농도별로 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 LPS처리군은 LPS 무처리군에 비하여 3배에 가까운 NO발현을 나타내었으며, 농도 의존적으로 NO발현을 억제하였다. LPS에 의해서 생성된 $PGE_2$의 생성억제 효과를 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리농도에서 ethanol 추출물이 26.2%의 저해율을 나타내었다. NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 농도에서 40%의 높은 억제효과를 나타내었으며, 농도 의존적으로 감소하는 경향을 관찰 할 수 있었다. LPS 처리시 또 다른 염증인자인 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리 농도에서 64%의 저해효과를 나타내었다. 잣나무잎 추출물이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성되는 $TNF-{\cdot}$, IL-6의 생성억제 효과를 측정한 결과 $25{\mu}g/mL$의 처리농도에서 각각 61.7, 62%의 저해 효과를 나타내었다. 따라서 잣나무잎 추출물은 염증억제를 위한 천연 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Hyaluronidase inhibitory activity as inflammatory factor of Koreinsis chinensis leaf ethanol extract was showed higher inhibitory activity than water extract. 29.5% inhibitory activity was shown at concentration of $200{\mu}g/mL$ phenolics. Lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 cells were treated with different concentrations ($5-25{\mu}g/mL$) of Koreinsis chinensis leaf extract and the amount of nitric oxide (NO) was determined; LPS-treated cells produced 3 times more NO than non-LPS treated cells. Moreover, the NO production in cells treated with Koreinsis chinensis leaf extract showed inhibitory effect in a concentration-dependent manner. Due to the stimulant-induced NO production is regulated by the inducible nitric oxide synthase (iNOS), we determined the iNOS protein level to elucidate the mechanism by which the NO production was inhibited. It was reduced by 40% with a Koreinsis chinensis leaf extract concentration of $25{\mu}g/mL$ and identified iNOS inhibition in dose-dependent manner. The prostaglandin $E_2$ production in cells treated with Koreinsis chinensis leaf extract was reduced by 26.2% at concentration of $25{\mu}g/mL$. The protein expression of cyclooxygenase-2 in LPS-treated Raw 264.7 cells was inhibited by 64% at $25{\mu}g/mL$ of Koreinsis chinensis leaf extract. Koreinsis chinensis leaf extract had a concentration-dependent inhibitory effect on the production of tumor necrosis factor-${\alpha}$ and interleukin-6 as pro-inflammatory cytokine in LPS-treated Raw 264.7 cells at $25{\mu}g/mL$ of Koreinsis chinensis leaf extract. Their levels were decreased by 61.7 and 62% respectively.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

따라서 본 연구에서는 국내에서 발생되어 수확되지 않고 방치되어 버려지는 임산폐자원인 잣나무(Pinus koraiensis) 잎 추출물에서 염증억제효과를 가지는 물질이 있음을 확인하고, 추출물의 염증 억제 효과를 macrophage cell 라인인 Raw cell을 이용하여 항염증 효과를 검정하기 위하여 세포내의 단백질의 변화를 Western blotting을 통하여 NO, PGE2, iNOS, COX-2 등의 protein expression억제효과와 proinflammatory cytokine의 억제 효과를 확인하여 약리성 식품 소재(medicinal food resources)로 활용하고자 하였다.

제안 방법

NO 측정은 cell의 supernatant에서의 NO의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태는 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였다.

대상 데이터

Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하였다.세포배양은 10% fetal bovine serum (HyClone, GE Healthcare Life Science, Chicago, IL, USA), 100 U/mL penicillin 및100 μg/mL streptomycin을 혼합한 배지를 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium으로 37 °C, 5% CO₂ incubator에서 72시간 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 23×10⁶/mL정도가 되게 계대 배양하여 5% CO₂ 조건으로 cell 상태를 유지하였다.
본 실험에 사용된 시료는 경북 영천지역에서 재배되고 있는 잣나무로부터 2015년에 채취하여 45 ℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh 분말로 만들어 4 °C 냉장 보관하며 시료로 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 실험결과는 평균±표준오차로 표기하였다. 분석에 영향을 미치는 모든 변수들은 SAS program (SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 처리 하였다(Statistical Analysis System Institute 2001).

이론/모형

세포 독성 측정은 Carmichael (1987)의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.

성능/효과

7 세포에서 높은 염증반응 억제 효과를 기대할 수 있었다. 따라서 잣나무 잎 ethanol 추출물은 염증억제를 위한 천연 기능성 소재로 활용이 가능할것으로 판단되었다.
Salidroside 추출물이 iNOS 저해 활성 측정에서 30%의 활성을 나타내었다는 Won 등(2008)의 보고보다 잣나무잎 ethanol 추출물이 저해 효과가 높았다. 따라서 잣잎 ethanol 추출물은 LPS에 의해 유도된 iNOS protein의 전사를 저해하여 염증반응 억제를 유도하는 물질임을 확인 할 수 있었다.
식물소재 중에서 오가피, 우슬, 석창포, 당귀,해동피, 갈근, 복분자 등의 추출물에서 10% 정도의 HAase저해활성을 보고한 문헌(Lee 2001)과 비교하면 잣잎 추출물의 항염증 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 잣잎 추출물은 염증 유발 요소인 HAase 저해로 인한 항염증, 아토피 억제효과를 활용하는 제품에 적용할 수 있을 것이라 판단되었다.
5%의 저해효과를 나타내어 ethanol 추출물에서 상대적으로 더 높은 HAase 저해효과를 보여주었다. 식물소재 중에서 오가피, 우슬, 석창포, 당귀,해동피, 갈근, 복분자 등의 추출물에서 10% 정도의 HAase저해활성을 보고한 문헌(Lee 2001)과 비교하면 잣잎 추출물의 항염증 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 잣잎 추출물은 염증 유발 요소인 HAase 저해로 인한 항염증, 아토피 억제효과를 활용하는 제품에 적용할 수 있을 것이라 판단되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	잣나무에 함유된 천연물은 무엇이 있는가?	잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로, Lee 등(2003)은 잣나무에 함유된 천연물로 5-hydroxy-7-methoxyflavone, chrysin, pinocembrin, galangin, pinosylvin, 3-hydroxy-5-methoxystilbene 등을 보고하였고, Bae등(2003)과 Cuyckens와 Claeys (2004)는 잣나무 잎의 성분으로는 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, scopoletin, (+)-catechin 등의 물질을 분리 동정하였다. 또한 Kim 등(2010)은 잣나무 잎에 존재하는 항균물질이 astragalin과 juglanin임을 보고하였다.
	macrophage가 염증을 일으키는 기전은 무엇인가?	생체의 면역기구로 골수에서 생산되는 탐식세포인 macrophage는 체내에 들어온 이물질을 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포인데, 미량의 그람 음성균의 외막 구성성분인 lipopolysaccharide에 의해 활성화되어 cytokine, 활성산소, nitric oxide (NO) 등을 생산, 방출하게 된다(Oshima와 Bartsch 1994; Gross와 Wolin 1995; Kroncke 등, 1998).특히, 대식세포에서 lipopolysaccharide와 같은 자극에 의해 염증 반응의 전사인자인 nuclear factor-κB를 활성화시켜 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 단백질을 발현시켜 과량의 NO와 prostaglandin E2를 생성하여 염증을 일으킨다(Stuehr 1999; So 등, 2004; Nirupama 등, 2005). 이때 interleukin-1β, IL-6 그리고 tumor necrosis factor와 같은 proinflammatory cytokine을 분비하여 염증반응에도 관여하게 된다(Naoko 등, 2005; Nirupama 등, 2005).
	macrophage는 무엇인가?	생체의 면역기구로 골수에서 생산되는 탐식세포인 macrophage는 체내에 들어온 이물질을 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포인데, 미량의 그람 음성균의 외막 구성성분인 lipopolysaccharide에 의해 활성화되어 cytokine, 활성산소, nitric oxide (NO) 등을 생산, 방출하게 된다(Oshima와 Bartsch 1994; Gross와 Wolin 1995; Kroncke 등, 1998).특히, 대식세포에서 lipopolysaccharide와 같은 자극에 의해 염증 반응의 전사인자인 nuclear factor-κB를 활성화시켜 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 단백질을 발현시켜 과량의 NO와 prostaglandin E2를 생성하여 염증을 일으킨다(Stuehr 1999; So 등, 2004; Nirupama 등, 2005).

참고문헌 (29)

Bae BH, Kim YO (2003) Effect of leaf aqueous extracts from some gymnosperm plant on the seed germination, seedling growth and transplant of Hibiscus syriacus varieties. Korean J Ecol 26: 37-47
Bunney S (1992) The illustrated encyclopedia of herbs. Chancellor press. London
Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF. Minna JD, Mitchell JB (1987) evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 47: 936-942

상세보기
Cheon YP, Mohammad LM, Park CH, Hong JH, Lee GD, Song JC, Kim KS (2009) Bulnesia Sarmienti Aqueous extract inhibits inflammation in LPS-stimulaged Raw 264.7 cells. J of life science 19: 479-485

원문보기 상세보기
Cho YJ, An BJ (2008) Anti-inflammatory effect of extracts from Cheongmoknosang (Morus alba L.) in Lipopolysaccharide stimulated Raw cells. J Kor Soc Appl Biol Chem 51: 44-48
Cho YJ, Chun SS, Kwon HJ, Yoon SJ, Lee KH (2005) Comparison of physiological activities between hot-water and ethanol extracts of Bokbunja (Rubus coreanum F.). J Kor Soc Food Sci Nutr 34: 790-796

원문보기 상세보기
Cuyckens F, Claeys MJ (2004) Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids. J Mass Spec 39: 1-15

상세보기
Dorfman A, Ott ML (1948) A turbidimetric method for the assay of hyaluronidase. J Biol Chem 172: 367-375
Ghosh P (1994) The role of hyaluronic acid (hyaluronan) in health and disease: interactions with cells, cartilage and components of synovial fluid. Clin Exp Rheumatol 12: 75-82

상세보기
Gross SS, Wolin MS (1995) Nitric oxide: pathophysiological mechanisms. Annu Rev Physiol 57: 737-769

상세보기
Kim JE, Kim WY, Kim JW, Park HS, Lee SH, Lee SY, Kim MJ, Kim AR, Park SN (2010) Antibacterial, atioxidative activity and component analysis of Pinus koraiensis leaf extracts. J Soc Cosmet Scientists Korea 36: 303-314
Kim NK, Kim MH, Yoon CS, Choi SW (2006) Studies on the antiinflammatory activity of paulownia coreana Uyeki leaf extracts. J Soc Cosmet Scientists Korea 32: 241-247
Kroncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V (1998) Inducible nitric oxide synthase in human diseases. Clin Exp Immunol 113: 147-156

상세보기
Lee HJ, Choi YJ, Choi DH, Hong IP (2003) Extractives of Pinus koraiensis wood. Mokchae Konghak 31: 49-56
Lee NH, Lee SJ, Jung DS, Bu HJ, Yang HC, Riu KZ (2001) Screening of the tyrosinase inhibition and hyaluronidase inhibition activities, and radical scavenging effects using plants in Cheju. Kor J Pharmacogn 32: 175-180
Moon TC, Park JO, Chung KW, Son KH, Kim HP, Kang SS, Chang HW (1999) Anti-inflammatory activity of the flavonoid components of Lonicera japonica. Yakhak Hoeji 43: 117-123
Naoko K, Satsuki K, Shinichi W (2005) IL-17 suppresses TNF- $\alpha$ -induced CCL27 production through induction of COX-2 in human keratinocytes. J Allergy and Clin Immun 116: 1144-1150

상세보기
Nirupama S, Anil KS, Battu A, Sangita M, Sudip G, Nasreen ZE (2005) Human resistin stimulates the pro-inflammatory cytokines TNF- $\alpha$ and IL-12 in macrophages by NF- ${\kappa}s$ -dependent pathway. Biochem and Biophy Res Comm 334: 1092-1101

상세보기
Oshima H, Bartsch H (1994) Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of nitric oxide in carcinogenesis. Mutat Res 305: 253-264

상세보기
Park GH, Lee JY, Kim DH, Cho YJ, An BJ (2011) Anti-oxidant and antiinflammatory effects of Rosa multiflora root. J Life Sci 21: 1120-1126

원문보기 상세보기
Park SH, Hwang HS, Han JH (2004) Development of drink from composition with medicinal plants and evaluation of its physiological function. Korea J Nutr 37: 364-372
Park SJ, Kim JY, Jang YP, Cho YW, Ahn EM, Baek NI (2007) Inhibition of LPS induced iNOS, COX-2 and cytokines expression by genistein-4'-O $\alpha$ -L-rhamnopyranosyl-(1-2)- ${\beta}$ -D-glucopyranoside through the NF- ${\kappa}B$ inactivation in Raw 264.7 Cells. Kor J Pharmacogn 38: 339-348
Park SJ, Shin JS, Cho W, Cho YW, Ahn EM, Baek NI (2008) Inhibition of LPS induced iNOS, COX-2 and cytokines expression by kaempferol-3-O- ${\beta}$ -D-sophoroside through the NF- ${\kappa}B$ inactivation in RAW 264.7 cells. Kor J Pharmacogn 39: 95-103
So MS, Lee JS, Yi SY (2004) Inhibition of nitric oxide and cytokines in Macrophages by Codonopsis lanceolata. Kor J Food Sci Technol 36: 986-990
Statistical analysis system institute (2001) SAS users guide. Version 8.1. Cary
Stuehr DJ (1999) Mammalian nitric oxide synthase. Biochem Biophys Acta 1411: 217-230
Syu-ichi K, Ai S, Ayako T, Takako H, Yu O, Mayuko U, Yutaro O, Norimichi N, Masaaki I (2005) Inhibitory effect of naringin on lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxin shock in mice and nitric oxide production in Raw 264.7 macrophages. Life Sciences 25: 1-9
Won SJ, Park HJ, Lee KT (2008) Inhibition of LPS induced iNOS, COX-2 and cytokines expression by salidroside through the NF- ${\kappa}t$ inactivation in RAW 264.7 cells. Kor J Pharmacogn 39: 110-117
Yoon WJ, Lee JA, Kim KN, Kim JY, Park SY (2007) In vitro antiinflammatory activity of the Artemisia fukudo extracts in murine macrophage Raw 264.7 cells. Kor J food sci technol 39: 464-469

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증