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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내에서 주로 소비되고 있는 감성돔(A. schlegeli), 참돔(P. major), 돌돔(O. fasciatus) 및 벵에돔(G. punctata)에 대한 기능성 식품으로서 영양적 가치를 평가하기 위하여 용매 극성에 따라 추출하여 인체 위암세포(AGS)와 인체 결장암 세포(HT-29)에 대한 세포 독성 효과를 비교 연구하였다.
제안 방법
- 4종의 돔 추출물의 인체 암세포에 대한 독성효과를 조사하기 위해 MTT assay를 시행하였다. DMSO에 의한 독성은 값이 거의 변화하지 않았으므로 DMSO에 의한 독성은 세포의 생존율에 아무런 영향을 미치지 않았다.
- major) 추출물을 용매 극성에 따라 분획하여 얻어진 n-hexane, 85% aq. MeOH, n-BuOH 및 water 분획물들에 의한 인체 암세포에 대한 세포독성 효과를 MTT assay를 시행하여 알아보았다. 85% aq.
- punctata)은 2015년 3월에 부산 자갈치 수산시장에서 구입하였다. 각각의 시료는 신선한 상태에서 머리와 꼬리, 내장을 제거한 후 뼈를 중심으로 반으로 나누어 5 mm 두께로 3등분으로 포를 떴으며 동결건조기를 이용하여 -45℃에서 20 Pa의 압력으로 3일간 건조시켰다. 건조된 시료는 분말화하여 실험 사용 전까지 -75℃ deep freezer(NF-400SF, NIHON FREEZER, Tokyo, Japan)에 냉동 보관하였다.
- 건조된 감성돔(25.8 g), 참돔(38.5g), 돌돔(64.6 g) 및 벵에돔(76.2 g)는 유기용매 추출을 위하여 acetone과 methylene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 시료가 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 추출액은 40℃ 수욕 상에서 rotary evaporator (N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 acetone/methylene chloride 추출물(A+M)을 얻었다.
- 배양된 암세포는 96 well cell culture plate에 5×104 cell/ml이 되도록 100 μl씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well 당 100 μl씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 μL씩 첨가하였다.
- 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO를 100 μl씩 분주하여 5~10분간 반응시켜 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- DMSO에 의한 독성은 값이 거의 변화하지 않았으므로 DMSO에 의한 독성은 세포의 생존율에 아무런 영향을 미치지 않았다. 암세포 종류로는 인체 위암세포(AGS) 및 인체 결장암세포(HT-29)가 사용되었으며 0.5, 1.25, 2.5, 5 및 10 mg/ml 농도로 세포독성을 평가하였다. Fig.
- 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% EDTA (GIBCO, Buffalo, NY, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 mm3 cell culture flask에 10 ml씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 수입산 감성돔(A. schlegeli), 참돔(P. major), 돌돔(O. fasciatus) 및 벵에돔(G. punctata)은 2015년 3월에 부산 자갈치 수산시장에서 구입하였다. 각각의 시료는 신선한 상태에서 머리와 꼬리, 내장을 제거한 후 뼈를 중심으로 반으로 나누어 5 mm 두께로 3등분으로 포를 떴으며 동결건조기를 이용하여 -45℃에서 20 Pa의 압력으로 3일간 건조시켰다.
- 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양 받아 본 실험실에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며 배양 중인 세포를 일주일에 2~3번 새로운 배지로 바꿔주었다.
데이터처리
- 실험결과는Mean ± SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고, 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 t-test를 실시하여 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 1은 4종의 돔 A+M 및 MeOH 추출물들을 AGS 암세포에 처리했을 때 세포독성 효과를 나타낸 것으로 농도 의존적으로 AGS 암세포에 대해 독성 효과를 나타내었다. A+M 추출물의 경우 첨가 농도 5 mg/ml 에서 참돔과 감성돔 추출물은 80% 이상의 높은 세포독성 효과를 나타내었으며 그 다음으로 벵에돔이 55%, 돌돔이 42%의 세포독성 효과를 보였다(Fig. 1A). 한편, MeOH 추출물의 경우 첨가 농도 5 mg/ml에서 참돔(P.
- 전반적으로 AGS 암세포의 결과와 비교했을 때 HT-29 암세포에 대한 세포독성 효과는 다소 낮았다. A+M 추출물의 경우 첨가농도 5 mg/ml에서 참돔(P. major) 추출물은 84%의 높은 세포독성 효과를 나타내었으며 벵에돔(G. punctata), 돌돔(O. fasciatus), 감성돔(A. schlegeli) 순으로 세포독성 효과를 보였다(Fig. 2A). 한편, MeOH 추출물의 경우 첨가 농도 5 mg/ml에서 참돔(P.
- MeOH, n-Hexane, n-BuOH 및 water 분획물들은 10 mg/ml의 농도에서 AGS 암세포에 대해 가장 높은 세포독성 효과를 나타내었으며 각각 95%, 91%, 91% 및 64%의 세포독성 효과를 보였다(p<0.05)(Fig. 3).
- major)은 다른 돔 종류와 비교했을 때 필수 아미노산의 함량이 높았다[1]. 따라서 선행연구를 기초로 하여 살펴본 결과 4종 돔의 생리활성 중 암세포에 대한 세포독성을 비교한 결과 참돔(P. major) 추출물에 의한 암세포 독성 효과가 높았음을 확인할 수가 있었다.
- major)의 총 고도불포화지방산의 함량이 가장 높게 나타났다[1]. 또한 4종 아미노산 조성을 비교한 결과 주요 아미노산은 glutamic acid, aspartic acid, lysine 및 leucine으로 확인되었으며 특히 참돔(P. major)은 다른 돔 종류와 비교했을 때 필수 아미노산의 함량이 높았다[1]. 따라서 선행연구를 기초로 하여 살펴본 결과 4종 돔의 생리활성 중 암세포에 대한 세포독성을 비교한 결과 참돔(P.
- 선행연구에서 4종 돔의 지방산 조성을 연구한 결과 참돔(P. major), 돌돔(O. fasciatus) 및 벵에돔(G. punctata)의 지방산 구성은 고도불포화지방산>포화지방산>단일불포화지방산 순으로 나타난 반면 감성돔(A. schlegeli)의 경우는 고도불포화지방산> 단일불포화지방산>포화지방산 순으로 나타났으며 이 중 참돔(P. major)의 총 고도불포화지방산의 함량이 가장 높게 나타났다[1].
- 06 mg/ml이었다(Table 1). 이상의 결과로부터 AGS 및 HT-29 암세포에 대해 참돔(P. major) 추출물에 의한 세포 독성이 가장 높게 나타났다. 선행연구에서 4종 돔의 지방산 조성을 연구한 결과 참돔(P.
- 2은 4종의 돔 A+M 및 MeOH 추출물들을 HT-29 암세포에 처리했을 때 세포독성 효과를 나타낸 것으로 농도 의존적으로 HT-29 암세포에 대해 독성 효과를 나타내었다. 전반적으로 AGS 암세포의 결과와 비교했을 때 HT-29 암세포에 대한 세포독성 효과는 다소 낮았다. A+M 추출물의 경우 첨가농도 5 mg/ml에서 참돔(P.
- 1B). 참돔(P. major), 감성돔(A. schlegeli), 돌돔(O. fasciatus) 및 벵에돔(G. punctata)의 A+M 추출물의 IC50 값은 각각 3.35, 6.16, 6.17 및 4.47 mg/ml이었고 MeOH 추출물의 경우 IC50 값은 각각 3.61, 5.52, 2.07, 및 6.06 mg/ml이었다(Table 1). 이상의 결과로부터 AGS 및 HT-29 암세포에 대해 참돔(P.
- 2A). 한편, MeOH 추출물의 경우 첨가 농도 5 mg/ml에서 참돔(P. major)과 돌돔(O. fasciatus) 추출물들은 약 80% 이상의 세포독성 효과를 나타났으며, 이어서 감성돔(A. schlegeli)과 벵에돔(G. punctata) 추출물이 약 65% 정도의 세포독성 효과를 보였다(Fig. 1B). 참돔(P.
- 1A). 한편, MeOH 추출물의 경우 첨가 농도 5 mg/ml에서 참돔(P. major)과 돌돔(O. fasciatus) 추출물이 약 80% 이상의 세포독성 효과를 나타났으며, 이어서 감성돔(A. schlegeli)과 벵에돔(G. punctata) 추출물이 약 43% 정도의 세포독성 효과를 보였다(Fig. 1B). Table 1은 4종의 돔 A+M 및 MeOH 추출물들의 IC50 값을 나타낸 것으로 참돔(P.
후속연구
- MeOH 분획물은 AGS 및 HT-29 세포 모두에서 가장 높은 세포독성 효과를 보여 85% aq. MeOH 분획물에 당지질 등 활성물질이 함유되어 있을 것으로 기대되고 본 연구 결과를 기초자료로 하여 향후 참돔의 다양한 생리활성 규명이 필요하다고 사료된다.
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