[논문]형질전환 돼지의 정자와 일반돼지의 정자성상에 대한 비교평가

박상현; 이건섭; 이주영; 김경운; 변승준; 옥선아; 황성수; 양현; 우제석; 오건봉

doi:10.12750/jet.2017.32.3.227

형질전환 돼지의 정자와 일반돼지의 정자성상에 대한 비교평가
Comparative Evaluation on Sperm Parameter of Transgenic Pigs with General Pigs 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.32 no.3, 2017년, pp.227 - 233

Abstract ▼ AI-Helper

Pig has been known to be one of the most feasible animals as a bioreactor to produce pharmaceuticals in milk and as a mediator in xenotransplantation research. Previously, we generated transgenic pigs for both purposes, which were expressing Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO in milk, along with expression of MCP at GalT gene locus ($GalT^{-MCP/-MCP}$) as well as expressing MCP at GalT gene loci with CD73 expression ($GalT^{-MCP/+}/CD73$). In this study, we performed comparative analyses of sperm parameters between wild type male (WT) pig and those transgenic males to examine the effects of transgenes integrated into the pigs on motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa. Our results showed that the rates of actively motile spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 85.0%, 83.3%, 82.5%, 83.3%, 82.5%, 77.5%, and 78.7%, respectively. Whereas, the rates of morphologically normal spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 90.0%, 80.0%, 80.0%, 83.3%, 85.0%, 91.8%, and 80.8%, respectively. In addition, the viability in spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 93.9%, 82.4%, 89.9%, 83.9%, 87.4%, 92.8%, and 83.6%, respectively. The rates of spermatozoa with normal acrosome integrity in WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 98.1%, 98.6%, 98.6%, 98.7%, 98.1%, 99.5%, and 95.1%, respectively. There were no significant differences in motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa among WT, Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs. These mean that neither random integration nor targeted integration of the transgene into chromosome of pig effect on characteristics of spermatozoa. Ultimately, the transgenic male pigs subjected in this study could apply to propagate their progenies for production of human therapeutic proteins and advancing the xenotransplantation research.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

돼지는 번식기간이 짧으며 다태 동물이라는 장점과 사람과 생리 해부학적으로 유사한 장점이 있어 유즙과 의약용으로 사용할 수 있는 단백질을 생산하려는 목적과 영장류에 세포와 조직 및 장기 이식에 활용하기 위한 목적으로 형질전환 연구가 활발히 진행되고 있다. 그런데, 형질전환으로 개발된 원조(founder) 돼지로부터 자연 교배를 통해 자손을 생산하는 번식 능력의 지표로 번식능력을 확인 할 뿐 대부분의 연구에서 수컷의 정자의 성상 분석을 실시하지 않아, 본 연구에서는 의약용 단백질을 유즙으로 생산하기 위하여 개발된 돼지와 이종이식에 활용할 목적으로 생산한 수컷돼지에서 도입한 유전자가 정자의 성상에 미치는 영향성을 분석하고자 실시하였다.
본 연구는 형질전환 돼지에 도입된 외래 유전자가 돼지 정자의 기능적 이상을 나타내는지에 대해 알아보고자 실시하였다. 유즙으로 사람 단백질을 분비하는 형질전환 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 수컷 돼지와 이종이식 연구를 위해 개발된 형질전환 GalT^-MCP/+/CD73, 및 GalT^-MCP/-MCP 수컷 돼지와 대조군으로 WT 돼지로부터 정액을 채취하여 정자의 운동성, 형태, 생존성, 첨체 온전성을 분석한 결과 WT 돼지와 통계적인 유의성이 발견되지 않았다.
본 연구팀에서 보유하고 있는 의료용 단백질 생산 목적으로 생산된 hEPO, Factor 8, vWf, htPA 형질전환 돼지와 더불어 이종이식에 활용할 목적으로 개발된 GalT^-MCP/-MCP 형질전환 돼지, 및 이 돼지와 CD73 돼지의 교배로 생산된 GalT^-MCP/+/CD73 돼지의 정자 성상 분석을 위하여 본 연구를 수행하였다.

제안 방법

본 연구팀에서도 돼지의 유즙으로 적혈구 생성을 촉진하여 빈혈 치료제로 사용이 가능한 사람 Erythropoietin(hEPO)을 분비하는 형질전환 돼지(이등, 2002)를 개발하였고, 혈우병 치료제로 사용이 가능한 사람 Factor 8(F8)과 Von Willebrand factor(vWf)를 분비하는 형질전환 돼지, 혈전용해제로서 사용할 수 있는 사람 Tissue plasminogen activator(TPA)를 분비하는 형질전환 돼지를 각각 개발하였다. 또한 이종장기 이식용을 활용하기 위하여 초급성 거부반응 유발 유전자인 alpha 1,3-galactosyltransferase(GalT) 유전자 좌위에 보체 조절 단백질의 하나인 membrane cofactor protein 유전자 발현 벡터가 삽입된 형질전환 돼지(GalT^-MCP/-MCP, Hwang 등, 2013; Ko 등, 2013)와 CD73 돼지(Lee 등, 2017)를 개발하였다.
채취된 정액은 30분 내로 실험실로 옮겼다. 옮겨진 형질전환 돼지정액은 Androhep® plus (Minitube, Germany) 희석제를 이용하여 1:1로 희석한 뒤 정자 성상 분석을 실시하였다.
일반적으로 정자의 운동성과 정자막의 온전성(Gadea 등, 1998) 및 첨체 온전성(Waberski 등, 2005) 등은 정자의 수정 능력을 평가하고 예측하는 지표로 활용되고 있는데, 이중에서 정자의 운동성은 수퇘지의 정자품질(Britt 등, 1999)과 수정능력(Flowers, 1997)을 평가하는 매우 유용한 지표로 이용되며, 정자의 운동성이 60% 이하일 경우 수태율이 저하된다고 보고되었다(Britt 등, 1999; Johnson 등, 2000). 이에 본 연구에서 유즙으로 사람 단백질을 분비하는 형질전환 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 수컷 돼지와 이종이식 연구를 위해 개발된 형질전환 GalT^-MCP/+/CD73, 및 GalT^-MCP/-MCP 수컷 돼지와 대조군으로 WT 돼지로부터 정액을 채취하여 재료 및 방법에서 제시한 것처럼 전진 운동성 분석을 실시하였다. Figure 4A와 같이 보이는 것처럼 운동성은 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 수컷 돼지에서 각각 83.

대상 데이터

공시 종모돈은 축산과학원에서 보유하고 있는 형질전환 Factor8, vWf, htPA, hEPO, GalT^-MCP/+/CD73, GalT^-MCP/-MCP 돼지 그리고 일반돼지(Wild type, WT)를 포함하여 총 17두를 실험에 공시하였다. 실험돈의 정액 채취는 수압법으로 이용하였고, 채취 전 종모돈의 포피 및 음경을 증류수로 세척한 뒤, 필터를 부착한 500 ml 돼지정액 전용 채취용 컵을 이용하였다.
본 연구에 공시된 형질전환 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 돼지는 미세주입 방법으로 생산된 후대이며, GalT^-MCP/+/CD73, 및 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 체세포의 핵 치환에 의한 복제 방법으로 생산된 개체의 후대이다. 배 등(2007; 2009)은 복제 방법으로 생산된 소와 일반 소의 정자 운동성을 분석했을 때, 복제소에서 유의적으로 높았고 정상적으로 후대를 생산하였다고 보고하였다.

데이터처리

본 연구 결과는 평균±표준오차로 나타냈으며, 이에 대한 통계분석은 Graphpad Prism 5 프로그램의 1 way ANOVA, Tukey’s Multiple Comparison Test를 이용하여 유의차 검정을 실시 하였다. p값이 0.
살아있는 정자의 운동성은 앞으로 진행하는 운동성을 보이는 전진운동성 (progressive motility)을 광학현미경 (200배 렌즈; OLYMPUS BX51TF, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. 운동성의 평가를 위해 10μL 정액을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스로 덮어 6개의 다른 시야에서 정자 운동성을 평가하였다.

이론/모형

돼지 그리고 일반돼지(Wild type, WT)를 포함하여 총 17두를 실험에 공시하였다. 실험돈의 정액 채취는 수압법으로 이용하였고, 채취 전 종모돈의 포피 및 음경을 증류수로 세척한 뒤, 필터를 부착한 500 ml 돼지정액 전용 채취용 컵을 이용하였다. 채취된 정액은 30분 내로 실험실로 옮겼다.
녹색으로 염색된 정자는 살아있는 정자로, 빨간색으로 염색된 정자는 죽은 정자로 평가하였다. 정자 생존성 평가는 Park과 Yu(2015)의 방법에 따라 암실에서 수행하였다.
정자 운동성 평가는 Rahman 등(2016)의 방법에 따라 수행하였다.
정자의 형태는 Diff-Quik (SYSMEX, Kobe, Japan) 염색법을 이용하여 400배 렌즈의 시야에서 최소한 200개의 정자를 광학현미경 (OLYMPUS BX51TF, Tokyo, Japan)으로 기형정자를 관찰하였다. 정자 형태 평가는 Gadea 등(2004)의 방법에 따라 수행하였다.
정자의 생존성은 SYBR-14/PI(Live/Dead^® Sperm Viability Kit (L-7011), Invitrogen)를 이용하여 평가하였다. 정액 100μl에 5μl SYBR와 5μl PI를 첨가하여 염색한 뒤, 염색된 시료를 10μl를 슬라이드 위에 떨어뜨려 정액 smear를 만들었다.
정자의 형태는 Diff-Quik (SYSMEX, Kobe, Japan) 염색법을 이용하여 400배 렌즈의 시야에서 최소한 200개의 정자를 광학현미경 (OLYMPUS BX51TF, Tokyo, Japan)으로 기형정자를 관찰하였다. 정자 형태 평가는 Gadea 등(2004)의 방법에 따라 수행하였다.
건조시킨 슬라이드는 488 nm excitation filter가 장착된 역상 형광현미경 (Leica DMI 6000B, Germany)을 이용하여 분석하였다. 첨체 온전성 평가는 Aboagla 와 Terada (2003)의 방법에 따라 암실에서 수행하였다.

성능/효과

본 연구는 형질전환 돼지에 도입된 외래 유전자가 돼지 정자의 기능적 이상을 나타내는지에 대해 알아보고자 실시하였다. 유즙으로 사람 단백질을 분비하는 형질전환 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 수컷 돼지와 이종이식 연구를 위해 개발된 형질전환 GalT^-MCP/+/CD73, 및 GalT^-MCP/-MCP 수컷 돼지와 대조군으로 WT 돼지로부터 정액을 채취하여 정자의 운동성, 형태, 생존성, 첨체 온전성을 분석한 결과 WT 돼지와 통계적인 유의성이 발견되지 않았다. 이는 적어도 본 연구에 공시된 돼지에 도입된 유전자는 정자 성상에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되며, 본 연구에 공시된 형질전환 돼지는 정자를 이용한 후대번식 통해 새로운 유전자원으로서 보존과, 실제 개발 목적에 따라 활용하기 위한 증식에 활용이 가능하다고 생각된다.

후속연구

Alm 등(2006)은 형태적으로 30% 이상의 비정상적인 정자를 인공수정에 이용했을 때 재 발정이 발생하는 비율이 크게 증가한다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 분석한 정자의 운동성, 형태, 생존성 및 첨체의 온전성 항목에서 형질전환 돼지와 WT 돼지 간 차이가 발견되지 않았으므로, 이를 바탕으로 본 연구에 공시된 형질전환 돼지의 정자를 이용한 후대번식은 새로운 유전자원으로서 보존과 실제 개발 목적에 따라 활용하기 위한 증식에 사용될 유용한 방법의 하나라고 생각된다.
실제 특정한 목적에 따라 개발한 형질전환 돼지를 그 목적에 맞게 활용하기 위해서는 축군 조성이 필수적이다. 본 연구에 공시된 돼지의 성상은 모두 정상으로 판명되어 각각 도입된 유전자의 영향은 미미한 것으로 판단되지만, 더 많은 수의 형질전환 개체의 정자 성상을 분석하여 도입된 유전자에 따라, 또는 개체에 따라 차이가 없는지 추가 분석이 필요하다고 생각된다.
유즙으로 사람 단백질을 분비하는 형질전환 Factor 8, vWF, hTPA, hEPO 수컷 돼지와 이종이식 연구를 위해 개발된 형질전환 GalT^-MCP/+/CD73, 및 GalT^-MCP/-MCP 수컷 돼지와 대조군으로 WT 돼지로부터 정액을 채취하여 정자의 운동성, 형태, 생존성, 첨체 온전성을 분석한 결과 WT 돼지와 통계적인 유의성이 발견되지 않았다. 이는 적어도 본 연구에 공시된 돼지에 도입된 유전자는 정자 성상에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되며, 본 연구에 공시된 형질전환 돼지는 정자를 이용한 후대번식 통해 새로운 유전자원으로서 보존과, 실제 개발 목적에 따라 활용하기 위한 증식에 활용이 가능하다고 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	형질전환동물로 최초로 개발된 것은 어떤 동물인가?	생쥐에서 최초로 형질전환 포유 동물 생산 기술이 개발된 이래(Costantini와 Lacy, 1981; Gordon과 Ruddle, 1981), 우수한 형질을 가진 개체 또는 목적에 따라 특정 형질이 추가된 토끼, 소, 면양 및 돼지 생산이 가능하게 되었다(Hammer등, 1985; Kato등, 1998; Wall 등, 1985). 특히 돼지는 사람과 해부학적 및 생리학적 특성이 유사하여 이종장기 이식을 위한 모델 동물(Cooper, 2012)과 세대 간격이 짧고, 산자수가 많기 때문에 유즙으로 의약용 단백질 생산을 위한 bioreactor 동물로 활용이 유리하다고 알려져 있다(Wall 등, 1991).
	원조동물로 개발된 형질전환 동물을 활용하기 위해서는 무엇이 필요한가?	원조 동물(founder animal)로서 개발된 형질전환 동물을 활용하기 위해서는 후대 증식 및 계통 조성 과정이 필요하게 되며, 이 기간을 단축시키기 위해 원조 동물 개발로서 수컷을 선호하게 된다. 이를 위한 번식 방법으로 인공수정이나 자연 교배를 실시하게 되는 데, 정액 및 정자의 성상 분석 및 평가를 통한 수정능력 검증은 필수적인 과정이다.
	형질전환 포유동물 중 돼지가 bioreactor 동물로 유리하다고 알려진 까닭은 무엇인가?	생쥐에서 최초로 형질전환 포유 동물 생산 기술이 개발된 이래(Costantini와 Lacy, 1981; Gordon과 Ruddle, 1981), 우수한 형질을 가진 개체 또는 목적에 따라 특정 형질이 추가된 토끼, 소, 면양 및 돼지 생산이 가능하게 되었다(Hammer등, 1985; Kato등, 1998; Wall 등, 1985). 특히 돼지는 사람과 해부학적 및 생리학적 특성이 유사하여 이종장기 이식을 위한 모델 동물(Cooper, 2012)과 세대 간격이 짧고, 산자수가 많기 때문에 유즙으로 의약용 단백질 생산을 위한 bioreactor 동물로 활용이 유리하다고 알려져 있다(Wall 등, 1991).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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