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문제 정의
- 이번 연구에서는 유효 물질의 피부 투과도를 높이기 위해 고압유화 공정을 이용하여 micro 단위 크기의 분자를 nano 단위 크기로 쪼개어 유화하였다. 그 후 고압유화 공정을 거친 nano 단위의 제제가 micro 단위의 제제보다 피부에 더 잘 투과되는지를 실험하고자 하였다. Ex vivo에서 경피 투과도를 측정하는 방법으로 Franz-type diffusion cells 방법이 가장 많이 사용된다[3].
- 본 연구는 각질 tape-stripping을 통해 비침습적으로 유효 물질의 투과도를 확인하고 유효 물질의 효능을 평가하기 위해 진행되었다. 피부는 장벽기능이 강하여서 외부의 물질이 침투하기 어렵다.
제안 방법
- 각 시험 부위에 각각 2 µL/cm2씩 시험시료 또는 대조시료를 도포하였다.
- 연구 대상자는 아침에 비누 및 일체의 세정제를 사용하지 않고 샤워를 한 뒤 전완부 및 안면을 물로 씻은 후 30 min간 항온⋅항습(20-24 ℃, 40-60% RH) 조건에서 안정을 취한 뒤 진행하였다.
- 그러나 이러한 방법은 피부에 미세한 상처를 발생시킨다는 단점이 있다. 이번 연구에서는 유효 물질의 피부 투과도를 높이기 위해 고압유화 공정을 이용하여 micro 단위 크기의 분자를 nano 단위 크기로 쪼개어 유화하였다. 그 후 고압유화 공정을 거친 nano 단위의 제제가 micro 단위의 제제보다 피부에 더 잘 투과되는지를 실험하고자 하였다.
- 라만을 이용할 경우 retinol, niacinamide, arbutin 및 vitamin C 등 분자구조를 알고 있는 특정한 유효성분의 피부 침투량을 계산할 수 있다[7]. 이번 연구에서는 tape-stripping으로 수집한 각질 sample을 이용하여 유효 물질의 침투량을 정량화하고 이미지로 나타내었다. 그리고 고압유화 공정을 거친 시료를 사용전과 사용 후에 색소침착 부위와 비 색소침착 부위의 피부색 변화를 측정하여 시료가 피부색 개선에 주는 영향을 평가하였다.
- 이번 연구에서는 tape-stripping으로 수집한 각질 sample을 이용하여 유효 물질의 침투량을 정량화하고 이미지로 나타내었다. 그리고 고압유화 공정을 거친 시료를 사용전과 사용 후에 색소침착 부위와 비 색소침착 부위의 피부색 변화를 측정하여 시료가 피부색 개선에 주는 영향을 평가하였다.
- 각 시험 부위에 각각 2 µL/cm2씩 시험시료 또는 대조시료를 도포하였다. 시료 적용 3 h 경과 후 Corneofix를 이용하여 동일 부위에 같은 압력을 이용하여 각질을 연속적으로 6장 떼어내고 처음 시료는 버린 후 두 번째 장부터 여섯 번째 장까지 총 다섯 장을 분석에 이용하였다.
- 01% formic acid)이 2 µL/min의 유속으로 spray capillary를 거치면 용액은 전하를 띄게 되는데, 이 전하들이 샘플 표면과 충돌하여 샘플 중 성분들을 기체 상태로 탈착 시켜 이온화시킨다. Waters Synapt G2-Mssystem를 이용하여 분자량 50-800 Da로 scan 한 후 niacinamide에 수소이온이 하나 붙은 m/z 123 (Chemical formula: C6H6N2O)과 pentaerythrityl tetraethylhexanoate(PTO)에 암모늄 이온이 하나 붙은 m/z 663 (Chemical formula: C37H68O8) 값을 선택하여 각각의 intensity를 확인하였다. HDI imaging 프로그램을 이용하여 선택한 각 성분의 intensity를 imaging으로 변환하였다.
- Waters Synapt G2-Mssystem를 이용하여 분자량 50-800 Da로 scan 한 후 niacinamide에 수소이온이 하나 붙은 m/z 123 (Chemical formula: C6H6N2O)과 pentaerythrityl tetraethylhexanoate(PTO)에 암모늄 이온이 하나 붙은 m/z 663 (Chemical formula: C37H68O8) 값을 선택하여 각각의 intensity를 확인하였다. HDI imaging 프로그램을 이용하여 선택한 각 성분의 intensity를 imaging으로 변환하였다.
- 시험시료의 색소침착 개선 및 피부톤(밝기) 평가를 위해 Visia-CR® (Canfiled Imaging System, USA)을 이용하여 연구 대상자의 안면을 촬영하였다.
- 시험시료의 색소침착 개선 및 피부톤(밝기) 평가를 위해 Visia-CR® (Canfiled Imaging System, USA)을 이용하여 연구 대상자의 안면을 촬영하였다. Cross-polarized mode로 촬영된 안면 사진의 색소침착 부위와 정상부위를 시험부위로 정하였다. Image 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 안면 사진의 색소 침착 부위와 정상부위에서 V 값의 평균을 도출하였다.
- Image 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 안면 사진의 색소 침착 부위와 정상부위에서 V 값의 평균을 도출하였다. 측정은 시료 도포 전, 도포 2주 후, 도포 4주 후 및 도포 6주 후에 진행하였다.
- DESI-MS와 Waters Synapt G2-Ms system를 이용하여 수용성 물질인 niacinamide와 지용성 물질인 PTO의 침투량을 imaging하였다. 첫 번째 tape-stripping한 각질은 측정에서 제외하였으므로 두 번째 장부터 여섯 번째 장까지 성분 분석 후 imaging한 결과 고압유화 공정을 거친 시험 시료가 대조시료에 비해 niacinamide와 PTO가 더 많은 양이 깊게 침투되었음을 확인할 수 있었다(Figure 2A,B).
- Niacinamide는 피부에 생성된 melanosome이 인접한 keratinocyte로 이동하는 것을 억제하여 피부 미백효과를 주는 주요한 미백 효능 원료이다[8]. 고압유화 공정을 거친 시험시료는 대조시료에 비하여 niacinamide가 피부 속으로 침투되는 양이 많고 더 깊게 침투되므로 시험시료의 사용 전후 미백 효능을 확인하였다. VISIA-CR®의 cross-polarized image를 통해 피부색을 촬영하여 이미지를 분석한 결과 사용 전 대비 사용 2주, 사용 4주 및 사용 6주 후 피부의 색소 침착이 점차 옅어지는 것을 확인하였다(Figure 4).
- DESI-MS를 이용하여 물질의 투과도를 이미징한 후 이미지분석 프로그램을 이용하여 각각의 intensity 값을 계산하여 정량화 하였다. Corneofix와 DESI-MS를 이용한 전박 부위의 intensity 값을 Wilcoxon signed-rank test를 이용하여 분석하였다.
- 피부는 장벽기능이 강하여서 외부의 물질이 침투하기 어렵다. 따라서 이번 연구에서는 유효물질을 피부 속을 침투시키기 위한 방법으로 고압유화 공정을 거쳐 입자 크기를 nano 사이즈로줄인 시료를 제작하였다(Figure 1). 피부 투과도를 측정하는 방법은 ex vivo에서 Franz-type diffusion cells 방법과 Plexiglas cell이 있으나 살아있는 인체에서 측정하기 어려움이 있다[3-5].
- 피부 투과도를 측정하는 방법은 ex vivo에서 Franz-type diffusion cells 방법과 Plexiglas cell이 있으나 살아있는 인체에서 측정하기 어려움이 있다[3-5]. 따라서 물질의 투과도를 비침습적으로 확인하기 위해 DESI-MS를 이용하여 imaging하였고 투과량을 정량화하였다(Figure 2, 3). Niacinamide는 피부의 미백에 효과가 알려져 있는 원료이다[9].
대상 데이터
- 본 연구는 한국 여성 20명(57.80 ± 4.40세)이 참가하였다.
- 본 실험에 사용한 시험시료는 41%의 오일이 함유된 O/W 유화제품에 1,000 bar, 3 cycles의 고압유화 공정(M110H-30, Microfluidics, USA)을 통하여 오일 입자의 입도를 작게 하여 균질화한 제품(IOPE plant stem cell signature ampoule (Amorepacific Co., Korea))을 사용하였다. 대조시료는 시험시료에서 고압유화 공정을 거치지 않은 시료를 사용하였다.
- , Korea))을 사용하였다. 대조시료는 시험시료에서 고압유화 공정을 거치지 않은 시료를 사용하였다. 시험 시료와 대조시료는 모두 Zetasizer (ZEN3600, Malvern, UK)를 이용하여 입자 사이즈를 측정하였다.
- 대조시료는 시험시료에서 고압유화 공정을 거치지 않은 시료를 사용하였다. 시험 시료와 대조시료는 모두 Zetasizer (ZEN3600, Malvern, UK)를 이용하여 입자 사이즈를 측정하였다.
데이터처리
- 통계 분석 프로그램 IBM SPSS statistics version 21.0을 이용하여 정규성 검정을 한 후 정규성을 만족하는 경우 repeated measures ANOVA 또는 t-test를 이용하여 분석하였고 정규성을 만족하지 않는 경우 Wilcoxon signed-rank test를 통해 분석하였으며 두 방법 모두 각 측정 시점에서 유의성 여부를 가설평균 차 5% (p <0.05)로 확인하였다.
- Cross-polarized mode로 촬영된 안면 사진의 색소침착 부위와 정상부위를 시험부위로 정하였다. Image 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 안면 사진의 색소 침착 부위와 정상부위에서 V 값의 평균을 도출하였다. 측정은 시료 도포 전, 도포 2주 후, 도포 4주 후 및 도포 6주 후에 진행하였다.
- DESI-MS를 이용하여 물질의 투과도를 이미징한 후 이미지분석 프로그램을 이용하여 각각의 intensity 값을 계산하여 정량화 하였다. Corneofix와 DESI-MS를 이용한 전박 부위의 intensity 값을 Wilcoxon signed-rank test를 이용하여 분석하였다. 시료 적용 3 h 경과 후 수용성 파트 및 지용성 파트에서 시험시료 적용부위의 intensity 값이 모든 각질 층에서 유의하게 높았으며(Figure 3A,B) 두 번째 장에서 여섯 번째 장의 intensity 값을 더해 물질 투과량 총량을 비교하였을 때에도 대조시료 적용 부위에 비하여 시험시료 적용 부위가 niacinamide가 1.
성능/효과
- Niacinamide의 침투량을 높인 시험시료를 피부에 도포하였을 때 색소침착 부위와 비 색소침착 부위의 피부색(명도, V value)가 개선되는 것을 정성적, 정량적으로 확인하였다(Figure 4, 5). 따라서 본 연구를 통해 각질 tape-stripping을 통해 비침습적으로 시료의 투과도를 시각적 및 정량적으로 확인할 수 있으며 고압유화 공정으로 입자의 크기를 줄인 시료는 유효물질의 피부 투과도가 높아 피부 미백에 도움을 주는 것으로 사료된다.
- 41%의 오일을 O/W로 첫 번째 유화를 시키고 이후 두 번째 고압 유화 공정(1,000 bar, 3 cycles)을 거쳐 오일입자 사이즈를 작게 만든 시험시료와 고압유화 공정을 거치지 않고 첫 번째 유화 공정만 거친 대조시료를 Zetasizer를 이용하여 측정한 결과 오일 입자의 크기가 고압 유화 공정 전에는 10 µm 또는 그 이상이 되는 입자가 많았으나(Figure 1A) 고압 유화 공정 이 후 오일 입자가 평균 138 nm로 작아진 것을 확인하였다(Figure 1B).
- DESI-MS와 Waters Synapt G2-Ms system를 이용하여 수용성 물질인 niacinamide와 지용성 물질인 PTO의 침투량을 imaging하였다. 첫 번째 tape-stripping한 각질은 측정에서 제외하였으므로 두 번째 장부터 여섯 번째 장까지 성분 분석 후 imaging한 결과 고압유화 공정을 거친 시험 시료가 대조시료에 비해 niacinamide와 PTO가 더 많은 양이 깊게 침투되었음을 확인할 수 있었다(Figure 2A,B).
- VISIA-CR®의 cross-polarized image를 통해 피부색을 촬영하여 이미지를 분석한 결과 사용 전 대비 사용 2주, 사용 4주 및 사용 6주 후 피부의 색소 침착이 점차 옅어지는 것을 확인하였다(Figure 4).
- VISIA-CR®의 cross-polarized image를 통해 피부색을 촬영하여 이미지를 분석한 결과 사용 전 대비 사용 2주, 사용 4주 및 사용 6주 후 피부의 색소 침착이 점차 옅어지는 것을 확인하였다(Figure 4). 색소 침착 부위와 비색소 침착 부위를 나누어 피부색을 Image-Pro Plus를 이용하여 피부색(명도, V value) 분석한 결과 색소 침착 부위는 사용 전 대비 사용 6주 후 0.486%, 비 색소 침착 부위는 0.403% 유의하게 개선되었다(Figure 5A,B).
- Corneofix와 DESI-MS를 이용한 전박 부위의 intensity 값을 Wilcoxon signed-rank test를 이용하여 분석하였다. 시료 적용 3 h 경과 후 수용성 파트 및 지용성 파트에서 시험시료 적용부위의 intensity 값이 모든 각질 층에서 유의하게 높았으며(Figure 3A,B) 두 번째 장에서 여섯 번째 장의 intensity 값을 더해 물질 투과량 총량을 비교하였을 때에도 대조시료 적용 부위에 비하여 시험시료 적용 부위가 niacinamide가 1.56배, PTO가 1.9배 통계적으로 유의한 수준으로 높았다(Figure 3C).
- Niacinamide는 피부의 미백에 효과가 알려져 있는 원료이다[9]. Niacinamide의 침투량을 높인 시험시료를 피부에 도포하였을 때 색소침착 부위와 비 색소침착 부위의 피부색(명도, V value)가 개선되는 것을 정성적, 정량적으로 확인하였다(Figure 4, 5). 따라서 본 연구를 통해 각질 tape-stripping을 통해 비침습적으로 시료의 투과도를 시각적 및 정량적으로 확인할 수 있으며 고압유화 공정으로 입자의 크기를 줄인 시료는 유효물질의 피부 투과도가 높아 피부 미백에 도움을 주는 것으로 사료된다.
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