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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 항천식 기능성식품 소재로서의 가능성을 알아보기 위해 배암차즈기 잎과 뿌리로부터 에탄올 추출물의 항산화 및 항알레르기 효과를 DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, SOD 유사활성, β-hexosaminidase를 측정하고, 염증성 cytokine의 발현을 분석하였다.
- 본 연구에서는 민간에서 기침, 천식, 염증 등에 효과가 있다고 알려져 있는 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물의 항산화 및 항알레르기 활성을 과학적으로 확인하였다. 항산화능의 측정 결과는 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 측정 하였을 때, 배암차즈기 잎과 뿌리의 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하여 높은 항산화 활성을 보였으며, 잎과 뿌리 사이의 통계적 차이는 보이지 않았다.
제안 방법
- β-Hexosaminidase 측정 − β-Hexosaminidase 방출 정도는 Huang 등18)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다.
- 26) 따라서 RBL-2H3 세포에서 분비되는 β-hexosaminidase의 활성을 측정하여 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물에 의한 β-hexosaminidase 방출 억제 효과를 알아보았다.
- DNP-IgE(0.5 µg/mL)를 첨가한 배지에 24시간 배양하고, PBS로 3회 세척 후 100 µg/mL의 시료를 넣은 배지에 2시간 반응시킨 다음, PBS로 3회 세척하고 2시간 동안 DNPBSA(2 µg/mL)를 처리하였다.
- DPPH Radical 소거능 − 각 추출물에 대한 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거능은 Blois 등15)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- Primer는 IL-4(Rn01456866_m1), IL-6(Rn01410330_m1), TNF-α(Rn99999017_m1), β-actin(Rn00667869_m1)을 사용하였으며, 95℃에서 10분간 denaturing 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 간격으로 40회 반복하여 증폭하였다.
- RBL-2H3 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Gibco, Grand Island, NY) 배지에 10% Fetal Bovin Serum(FBS; Invitrogen, Carlsbad, USA)와 100 units/mL penicillin streptomycin(HyClone,Logan, UT) 을 첨가한 배지를 사용하여 5% CO2가 공급되는 CO2 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
- RNA 2 µg을 추출하여 High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems; Foster City, CA, USA)를 사용하여 합성하였으며, mRNA 발현은 TaqMan analysis를 이용하여 Step-OnePlus RT-PCR System(Applied Biosystems)에서 실행하였다.
- RT-PCR − 24-well plates에서 배양된 RBL-2H3 세포에 TRIzol Reagent(Invitrogen, CA, USA) 1 mL씩 가하여 Invitrogen사의 메뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다.
- 희석한 용액 300 µL에 농도별 시료 20 µL를 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼의 제거활성으로 나타냈으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다.
- )는 경기도 파주시농업기술센터의 형태학적 평가를 통해 동정된 것을 구입하였고, 증거표본(RDASPR14)은 농식품자원부에 보관하였다. 배암차즈기를 수세 후 잎과 뿌리로 각각 나눠 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea) 한 후 균일하게 분쇄하여 시료 100 g에 중량 대비 20배의 70% 발효주정을 가하고, 실온에서 24시간씩 2회 반복하여 교반추출(Jeio tech sk-71, Lab companion, Daejeon, Korea)하였다. 추출물은 ADVANTEC paper(No.
대상 데이터
- 세포배양 − Rat의 비만세포인 RBL-2H3 세포는 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다.
- 재료 및 추출 − 본 연구에 사용된 배암차즈기(Salvia plebeia R.)는 경기도 파주시농업기술센터의 형태학적 평가를 통해 동정된 것을 구입하였고, 증거표본(RDASPR14)은 농식품자원부에 보관하였다.
- 배암차즈기를 수세 후 잎과 뿌리로 각각 나눠 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea) 한 후 균일하게 분쇄하여 시료 100 g에 중량 대비 20배의 70% 발효주정을 가하고, 실온에서 24시간씩 2회 반복하여 교반추출(Jeio tech sk-71, Lab companion, Daejeon, Korea)하였다. 추출물은 ADVANTEC paper(No.6)(ADVANTEC Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 감압여과하고, 감압농축기(EYELA N-1000, Riakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후 동결건조 하여 -70℃에서 보관하며 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Data are presented as the mean±S.E. Mean with different letters on the bar are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Data are presented as the mean±S.E. Mean with different letters on the bar are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- One-way ANOVA(one-way analysis of variance; 일원배치 분산분석)를 실시 한 후 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
- 통계처리 − 모든 실험결과의 통계적 분석은 SAS 프로그램(package version 9.2, Korea)을 이용하여 실시하였으며, 평균±표준오차로 표시하였다.
이론/모형
- ABTS Radical 소거능 − ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)] radical 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay16)를 이용하여 측정하였다.
- Superoxide Dismutase(SOD) 유사활성 − Superoxide dismutase(SOD) 유사활성은 Marklund와 Marklund17)의 방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 3) 약용식물의 항산화 활성물질은 인체 내에 존재하는 활성산소방어 효소인 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GPX), catalase(CAT), glutathione reductase 등을 보완하고, 활성산소종(ROS)에 의한 면역력 저하,4) DNA 손상,5) 장기 및 조직손상6) 등의 개선에 효과를 나타낸다. 일반적으로 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 butylated hydroxytoluen(BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), propyl galate(PG)는 우수한 항산화성과 경제성으로 널리 사용되어 왔지만, 장기간 섭취 시 간, 폐, 신장, 위장, 순환계 등에 심각한 독성을 일으키는 것으로 알려져 그 사용량에 제한이 있다7).
- DNP-IgE와 BSA로 활성화 된 RBL-2H3 세포에서의 항알레르기 효과는 추출물을 처리하지 않은 control군과 비교 하였을 때, 100 µg/mL 농도에서 잎과 뿌리 추출물 모두 β-hexosaminidase를 유의하게 감소시켜 항알레르기 효과를 나타내었다.
- IL-4와 TNF-α의 mRNA 발현은 RBL-2H3 세포에 IgE를 감작 시킨 후 DNPBSA만 처리한 control군과 비교한 결과, 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물을 100 µg/mL 농도로 처리 했을 때 모두 감소하는 경향을 보였다(p<0.05).
- 항산화능의 측정 결과는 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 측정 하였을 때, 배암차즈기 잎과 뿌리의 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하여 높은 항산화 활성을 보였으며, 잎과 뿌리 사이의 통계적 차이는 보이지 않았다. SOD 유사 활성은 잎과 뿌리 추출물 모두 농도 증가에 따른 활성을 나타내었고, 가장 높은 농도에서 잎 추출물이 뿌리 추출물보다 약 3배 높은 활성을 나타내었다.
- 5배 높은 SOD 유사활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 배암차즈기 잎 추출물은 생체 산화에서 중요한 역할을 하고 효과적인 superoxide radical 소거능이 있는 것으로 나타났다. 산화 스트레스, 염증성 cytokine 및 바이러스 등의 자극이 염증이나 알레르기와 관련된 것으로 알려져 있는데24), 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물의 항산화 효과는 천식 등의 항알레르기 치료에 긍정적으로 작용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 결론적으로 배암차즈기 잎과 뿌리 추출물은 높은 항산화능을 가지며, IL-4와 TNF-α의 발현 억제로 염증반응 관련 알레르기성 천식을 개선 및 예방 할 수 있어 기능성소재로서 이용가치가 높은 것으로 나타났다.
- 7%를 나타내었다. 또한 잎과 뿌리의 에탄올 추출물을 같은 농도별로 비교하였을 때, 잎의 추출물이 뿌리의 추출물보다 약 2배에서 3.5배 높은 SOD 유사활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 배암차즈기 잎 추출물은 생체 산화에서 중요한 역할을 하고 효과적인 superoxide radical 소거능이 있는 것으로 나타났다.
- 배암차즈기 뿌리의 에탄올 추출물은 250, 500, 1000 µg/mL 농도에서 각각 15.4±0.3, 31.4±0.3, 58.2±0.1%의 소거능을 나타내어 농도 의존적으로 유의적인 증가를 나타내었으며, 잎과 뿌리의 추출물 사이에 유의적인 차이를 보이지는 않았다.
- 1%의 소거능을 나타내었다. 배암차즈기 잎과 뿌리의 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적인 DPPH radical 소거능을 보였으며, 각각의 같은 농도에서 잎과 뿌리 추출물 간의 유의적 차이는 보이지 않았다. 배암차즈기의 항산화능에 대한 연구에서 Lim 등2)은 배암차즈기 메탄올 추출물의 DPPH radical 소거능이 농도의존적으로 증가되었으며, RC50 값이 51.
- 배암차즈기 잎에서 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거능은 250, 500, 1000 µg/mL 농도에서 각각 24.9±2.5, 40.5±1.1, 57.9±5.8%를 나타내었으며, 뿌리의 에탄올 추출물은 250, 500, 1000 µg/mL 농도에서 각각 24.2±1.2, 39.9±0.7, 64.8±0.1%의 소거능을 나타내었다.
- 배암차즈기 잎으로부터 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거능은 250 µg/mL 농도에서 19.2±0.7%의 소거능을 나타내었고, 농도 증가에 따라 유의적으로 증가하여 500 µg/mL와 1000 µg/mL 농도에서는 각각 35.5±0.5%와 63.1±0.8%를 나타내었다.
- 배암차즈기 잎의 에탄올 추출물의 SOD 유사활성은 250, 500, 1000 µg/mL 농도에서 각각 17.3±0.3, 32.2±0.2, 57.0±1.2%를 나타내 농도 증가에 따른 유의적 증가로 우수한 SOD 유사활성을 보였다.
- 시료를 처리하지 않고 IgE를 감작 시킨 후 DNP-BSA만 처리한 control군의 β-hexosaminidase 방출이 100.0±0.5%일 때 100 µg/mL 농도에서 DNP-BSA를 처리한 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물은 각각 77.3±1.0, 75.8±0.7%으로 유의적인 감소를 보였다(p<0.05).
- 특히 배암차즈기 잎 추출물에서 뿌리 추출물보다 IL-4와 TNF-α의 mRNA 발현이 유의적으로 감소함을 나타내었지만, 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물은 100 µg/mL 농도에서 IL-6의 mRNA 발현에 유의적인 영향을 주지는 않았다.
- 본 연구에서는 민간에서 기침, 천식, 염증 등에 효과가 있다고 알려져 있는 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물의 항산화 및 항알레르기 활성을 과학적으로 확인하였다. 항산화능의 측정 결과는 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 측정 하였을 때, 배암차즈기 잎과 뿌리의 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하여 높은 항산화 활성을 보였으며, 잎과 뿌리 사이의 통계적 차이는 보이지 않았다. SOD 유사 활성은 잎과 뿌리 추출물 모두 농도 증가에 따른 활성을 나타내었고, 가장 높은 농도에서 잎 추출물이 뿌리 추출물보다 약 3배 높은 활성을 나타내었다.
후속연구
- 본 연구 결과 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물은 β-hexodaminidase 방출 및 cytokine 생성을 현저하게 억제하였으므로 항알레르기 효과를 나타내는 건강기능식품 개발 등에 사용 가능할 것으로 생각된다.
- 이로써 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄올 추출물은 탈과립 및 알레르기 관련 cytokine(IL-4, TNF-α)의 발현 감소와 항알레르기 효과를 나타내어, 천식과 같은 알레르기성 질병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 기대된다.
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