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문제 정의
- ,1999). 이에 본 연구에서는 호흡기염증 질환에 유효한 천연물 자원을 이용한 치료제 개발을 목표로 3종의 배암차즈기 추출물을 대상으로 호염기성 백혈병 세포 (RBL-2H3 cell)을 이용한 5-LO 억제 작용 실험을 통하여 염증 질환에 대한 치료 효과를 확인하고, 주요 활성 성분을 구명하고자 한다.
제안 방법
- Ethyl acetate 분획물 10g을 silica column (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 첨가시킨 후 chloroform과 methanol 비율 (100 : 1, 50 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 3 : 1, 1: 1, methanol)을 달리한 용액으로 용출 및 건조해서 제조하였다.
- 높은 leukotriene 억제를 보인 silica column chromatography 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1 분획물에 포함되어 있을 것으로 보이는 예상되는 물질인 rosmarinic acid, hispidulin, luteolin의 UV spectrum과, HPLC로 물질을 분리해 각 peak별 용출 시간 및 UV-spectrum을 비교해 실제 배암차즈기 활성성분 분획물에 위의 물질들이 포함되어 있는지 확인하였다 (Fig. 6).
- 배암차즈기 50% 주정 조추출물에서 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, butanol, DW로 액체-액체 추출법을 이용해 얻은 분획물을 50㎍/㎖의 농도로 처리해 leukotriene 발현억제를 확인하였다 (Fig. 3).
- 배암차즈기 용매별 분획물은 50% 주정으로 추출한 조추출물 50g을 1차 증류수 1ℓ에 녹인 후 순차적으로 n-hexane 3ℓ, methylene chloride 3ℓ, ethyl acetate 3ℓ, butanol 3ℓ로 3회 반복하여 분획하여 제조하였다. 배암차즈기 ethyl acetate 분획물은 50% 주정으로 추출한 조추출물 40g을 1차 증류수 2ℓ에 완전 용해시킨 후 분액여두에 넣고 ethyl acetate 1ℓ에 잘 희석시킨 후, 두 용매가 분리될 때까지 약 4시간 정도 방치하였다.
- 배암차즈기 종류별 leukotriene 발생 억제 효과를 확인하기 위해 배암차즈기, 참배암차즈기, 둥근배암차즈기 메탄올 추출물을 한국식물추출물은행으로부터 분양받아서 leukotriene 발현억제를 비교 평가하였다 (Fig. 1).
- 배암차즈기 추출물의 대량 제조를 위해 건조된 배암차즈기 (S. Plebeia R. BR., 2014년 4월 부안산) 지상부 500 g을 고루 섞은 후 3차 증류수에 희석하여 제조한 0, 10, 30, 50, 70 혹은 90% 주정 10 ℓ 이용해서 80℃에서 2.5시간동안 열탕 추출하였다. 여액을 모은 후 잔사는 동일한 방법으로 재추출하여 그 여액을 합하여 45℃에서 배암차즈기 추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다.
- 배암차즈기에서 다른 곰보배추들보다 더 높은 leukotriene 발현 억제를 보여주는 바, 다양한 농도로 희석한 주정 (0 -95%)으로 추출한 배암차즈기 조추출물을 50㎍/㎖의 농도로 처리해 각각의 추출용매에 따른 leukotriene 발현억제를 정량했다 (Fig. 2).
- 실험에 사용한 추출물을 0.45 ㎛ syringe filter (Merk Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용해 부유물을 제거하고 아래 표와 같은 조건에서 분석하였다 (Table 1, 2)
대상 데이터
- Rat basophilic leukemia cell (RBL-2H3)을 10% FBS, 1% antibiotics가 포함된 DMEM (complete DMEM)으로 5% CO2, 37℃ incubator에서 T-75 culture flask에 배양하였다. 계대 배양은 세포가 T-75 culture flask에 70 -80% 가량 찼을 때, 배양액을 제거 및 PBS 3㎖로 세척하였다.
- 배암차즈기 종류별 성분 및 활성 비교 평가를 위해서 한국 식물추출물은행에서 분양받은 배암차즈기 (PB4388.1, Korea Plant Extract Bank), 둥근배암차즈기 (PB4390.1, Korea Plant Extract Bank), 참배암차즈기 (PB4391.1, Korea Plant Extract Bank)의 메탄올 추출물을 사용하였다.
- 실험에 사용한 주정 (발효 에탄올)은 삼전순약공업주식회사 (Pyeongtek, Korea)에서, acetonitrile, chloroform, ethyl acetate, n-hexane, methanol, methylene chloride, 1-butanol은 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서, dimethyl sulfoxide (DMSO), calcium ionophore, hispidulin, luteolin, montelukast, rosmarinic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, Dulbecco’s modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin-amphotericin B (Antibotics), phosphate bufferd saline (PBS), 0.25% Trypsin-EDTA (TE)는 Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었으며 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS ver. 12.0 (statistical package for social science ver. 12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 t 검정을 시행하였다.
이론/모형
- 이후 상층액을 모아 1,500rpm에서 원심 분리해 잔여세포를 침전시키고, 다시 상층액을 취해 −20℃에 보관한다. 상층액에 포함된 leukotriene의 농도는 cysteinyl lekotriene EIA kit (ADI-901-070, Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, USA)를 이용해 제조사에서 제공한 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- 10 ㎍/㎖의 배암차즈기, 참배암차즈기, 둥근배암차즈기 조추출물 처리하였을 때, 각각 91.2 ± 8.7%, 121.2 ± 22.3%, 106.3± 13.2%로 대조군 대비 유의미한 변화는 관찰되지 않았다 (p > 0.05).
- Ethyl acetate 분획물로부터 open chromatography법을 이용해 chloroform과 methanol의 비율을 달리한 용매로 분획해 20 ㎍/㎖의 농도로 처리해 leukotriene 발현을 정량한 결과 chloroform:methanol의 비율이 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1 분획물의 경우 control 대비 각각 90.8%, 88.0%, 92.8% leukotriene의 유의미한 발현억제를 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
- Silica column chromatography 20 : 1, 10 : 1 분획물을 HPLC로 확인한 결과, 여러 peak중 40.2분경에 용리된 peak에서 나타난 UV-spectrum은 단일 hispidulin의 UV-spectrum과 동일한 모양을 보여 활성 분획물에 hispidulin이 포함되어 있는 것으로 보인다 (Fig. 7).
- 동일한 방법으로 silica column chromatography 5 : 1 분획물에서 36.1분경 나타난 peak의 UV-spectrum을 rosmarinic acid의 UV-sepctrum과 비교했을 때, 동일한 모양의 UVspectrum이 관찰되어 rosmarinic acid가 포함되어 있을 것으로 보이며 (Fig. 8), 같은 추출물에서 29.2분경 얻은 peak에서 luteolin와 동일한 모양의 UV-spectrum을 얻어 luteolin가 있음을 추측할 수 있었다 (Fig. 9).
- 또한, 50% 주정추출물과 ethyl acetate 추출물간 rosmarinic acid, hispidulin, luteolin의 농도를 정량 분석한 결과 단위 무게당 위의 세 물질의 농도가 각각 3.55, 13.31, 17.15 배 이상 함유되어 있어 주정 추출 후 ethyl acetate로 재추출했을때, 항염증 활성 및 활성성분이 더 많이 포함된 분획물을 얻을 수 있었다 (Table 3). 이와 같은 결과로부터 항염 활성을 나타내는 배암차즈기 추출물의 표준화를 위한 유효 및 지표성분으로 rosmarinic acid, hispidulin, luteolin 등을 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- , 2016). 실제 이들 화합물이 leukotriene 발현억제에 기여하는지를 확인한 결과, rosmarinic acid, hispidulin, luteolin을 각각 5, 10, 20 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 모두 농도의 존적으로 leukotriene 발현 억제가 증가하였다 (Fig. 5).
- 실험결과 10 -50%의 주정에서 추출되었을 때, 각각 66.9 ± 6.8%, 53.6 ± 8.3%, 53.0 ± 7.7%로 다른 농도의 주정으로 추출한 조추출물보다 높은 leukotriene 발현억제를 보였다.
- 용매 종류별 분획물에 대한 leukotriene 발현억제 활성은 nhexane에서 62.9 ± 7.7%, methylene chloride에서 50.3 ± 16.3%, ethyl acetate에서 19.7 ± 2.4%, 1-butanol에서 68.8 ± 2.1%으로 control 군 대비 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
- 이들 화합물이 본 연구에서 진행한 배암차즈기 조추출물에 얼마나 포함되어 있는지 살펴보기 위해 HPLC를 이용해 정성 분석한 결과 배암차즈기 50% 조추출물에서 hispidulin, luteolin, rosmarinic acid을 확인할 수 있었다 (Fig. 10).
- 하지만 ethyl acetate 분획물을 제외한 다른 용매 분획물에서는 배암차즈기 50% 주정 조추출물과와 비슷하거나 보다 낮은 leukotriene 발현억제를 확인할 수 있었다. 이를 통해 ethyl acetate 분획물이 가장 높은 항염증 활성이 나타남을 알 수 있었다.
- 하지만 농도를 50 ㎍/㎖로 처리하였을 때, 배암차즈기, 참배암차즈기, 둥근배암차즈기는, 각각 34.3 ± 2.5%, 71.0 ± 10.7%, 73.4 ± 5.8%로 control 대비 leukotriene의 유의미한 감소가 관찰되었으며, 이중 배암차즈기 조추출물이 가장 높은 leukotriene 발현억제가 관찰되었다.
후속연구
- 15 배 이상 함유되어 있어 주정 추출 후 ethyl acetate로 재추출했을때, 항염증 활성 및 활성성분이 더 많이 포함된 분획물을 얻을 수 있었다 (Table 3). 이와 같은 결과로부터 항염 활성을 나타내는 배암차즈기 추출물의 표준화를 위한 유효 및 지표성분으로 rosmarinic acid, hispidulin, luteolin 등을 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
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