인동덩굴로부터 분리된 Cynaroside이 Doxorubicin으로 유도된 인간 근위세뇨관 HK-2 세포의 괴사에 미치는 저해 효과 Inhibitory Effect of Cynaroside Isolated from Lonicera japonia Thunb on Doxorubicin-induced Necrosis in Human Renal Proximal Tubular HK-2 Cells원문보기
Background: Cynaroside is a flavone, a flavonoid-like compound, known by different names (luteoloside and cinaroside). It is commonly found in Lonicera japonica Thunb., Chrysanthemum moriflium, and Angelica keiskei. The process of cell death has been classified as necrosis and apoptosis. Necrosis re...
Background: Cynaroside is a flavone, a flavonoid-like compound, known by different names (luteoloside and cinaroside). It is commonly found in Lonicera japonica Thunb., Chrysanthemum moriflium, and Angelica keiskei. The process of cell death has been classified as necrosis and apoptosis. Necrosis refers to unregulated cell death induced by a chemotherapeutic agent. Doxorubicin is an anthracycline anti-cancer drug used to treat acute leukemia, cancer, and lymphoma. However, it induces nephrotoxicity including tubular damage. Therefore, we investigated the protective effect of cynaroside against doxorubicin-induced necrosis in HK-2 cells. Methods and Results: To confirm the beneficial effect of cynaroside on doxorubicin-induced necrosis, HK-2 cells, a human proximal tubule epithelial cell line were treated with $10{\mu}M$ doxorubicin and $80{\mu}M$ cynaroside. Doxorubicin treatment resulted in increased DNA fragmentation, caspase-3 activity and mitochondria hyperactivation during cell necrosis. However, pretreatment with $80{\mu}M$ cynaroside attenuated DNA fragmentation, caspase-3 activity and mitochondria hyperactivation induced by $10{\mu}M$ doxorubicin in HK-2 cells. Conclusions: These results indicated that pretreatment with cynaroside ameliorated doxorubicin-induced necrosis in HK-2 cells. Therefore, cynaroside be used as a therapeutic agent for improving doxorubicin-induced nephrotoxicity. However, further studies are required to evaluated the toxicity of cynaroside treatment in animals and to determine its protective effect against doxorubicin-induced nephrotoxicity in an animal model.
Background: Cynaroside is a flavone, a flavonoid-like compound, known by different names (luteoloside and cinaroside). It is commonly found in Lonicera japonica Thunb., Chrysanthemum moriflium, and Angelica keiskei. The process of cell death has been classified as necrosis and apoptosis. Necrosis refers to unregulated cell death induced by a chemotherapeutic agent. Doxorubicin is an anthracycline anti-cancer drug used to treat acute leukemia, cancer, and lymphoma. However, it induces nephrotoxicity including tubular damage. Therefore, we investigated the protective effect of cynaroside against doxorubicin-induced necrosis in HK-2 cells. Methods and Results: To confirm the beneficial effect of cynaroside on doxorubicin-induced necrosis, HK-2 cells, a human proximal tubule epithelial cell line were treated with $10{\mu}M$ doxorubicin and $80{\mu}M$ cynaroside. Doxorubicin treatment resulted in increased DNA fragmentation, caspase-3 activity and mitochondria hyperactivation during cell necrosis. However, pretreatment with $80{\mu}M$ cynaroside attenuated DNA fragmentation, caspase-3 activity and mitochondria hyperactivation induced by $10{\mu}M$ doxorubicin in HK-2 cells. Conclusions: These results indicated that pretreatment with cynaroside ameliorated doxorubicin-induced necrosis in HK-2 cells. Therefore, cynaroside be used as a therapeutic agent for improving doxorubicin-induced nephrotoxicity. However, further studies are required to evaluated the toxicity of cynaroside treatment in animals and to determine its protective effect against doxorubicin-induced nephrotoxicity in an animal model.
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문제 정의
이에 따라 인간 근위세뇨관에서 유래된 세포주인 HK-2 세포 (human kidney proximal tubule cell)를 이용하고, doxorubicin을 처리해 신장독성을 유발시킨 뒤 cynaroside를 처리하여 in vitro 수준에서 천연분리물질의 신장독성 억제 효과가 나타나는지 조사해보고자 하였다.
이러한 결과를 바탕으로 doxorubicn에 의한 세포사 억제 효과를 확인해본 결과, doxorubicin 처리에 의한 세포독성은 40 µM cynaroside를 처리했을 때 doxorubicin 단독처리 군에 비교하여 세포생존율이 크게 회복되었다. 종합하면 cynaroside는 doxorubicin으로 유도된 세포사로부터 세포생존율을 회복시켜 신장세포보호 효과가 있음을 확인하였지만 정확히 어떠한 기전에 영향을 미치는지 확인하기 위해 추가실험을 진행하였다.
제안 방법
Cynaroside가 doxorubicin에 의해 유도된 necrosis의 억제 비율을 알아보기 위해 annexinV-PI 염색을 통해 flow cytometry에서 측정하였다. 10 µM doxorubicin을 처리하였을 때 necrosis 비율이 77.
Cynaroside를 여러 농도 (10, 20, 40 and 80 µM)로 HK-2 세포에 24 시간 동안 처리하였다.
세포를 96 well plate에 1 × 105 cells/㎖ 농도가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. cynaroside를 여러 농도로 24 시간 동안 처리 후 HK-2 세포에 대한 천연분리물질의 독성을 확인하였다.
그 후 2 × SSC buffer를 동안 처리하고, PBS로 2 번 씻은 뒤 Prolong™ gold antifade mountant with DAPI(Thermo Fisher Scienrific Inc., Waltham, MA, USA)로 mount하고 Epi-fluorescence microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용해 관찰하였다.
그 후 키트에서 제공한 MTS 시약 20 ㎕를 넣고 2 시간 동안 배양한 뒤 microplate reader infinite® 200 PRO (TECAN, Männedorf, Switzerland)를 이용해 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포생존율은 비처리군에 대한 생존율을 %로 표시하였다.
, Farmingdale, NY, USA)를 이용해 실험을 수행하였다. 단백질 분석 방법에서 사용한 방법과 동일하게 세포를 용해하였으며, 총 20 ㎍의 단백질을 사용해 제조사가 제공한 protocol에 따라 실험을 수행했다.
마지막으로 DNA 단편화를 측정하기 위해 TUNEL 염색을 실시하였다. 10 µM doxorubicin 처리시 tunel positive signal이 증가할 뿐만 아니라 세포의 형태가 변화되었지만 이는 80 µM cynaroside 전 처리에 의해 정상에 가깝게 차단되었다(Fig.
, Farthingale, NY, USA)를 사용했다. 세포에 약물 처리 후 유도되는 necrosis의 비율을 구하기 위해 제조사에서 제공한 protocol에 따라 Annexin VFITC와 PI 시약으로 염색시켰으며, necrosis중 과활성화되는 미토콘드리아의 활성을 측정하기 위해 JC-1 Dye (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 실험을 진행하였고 세포는 CytoFLEX (Beckman clulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용해 분석하였다.
세포용해액은 원심분리기로 4℃, 13,000 × g 조건에서 10 분간 원심분리 하였고, 단백질 농도를 bradford assay를 이용하여 측정하였다.
3A]. 이어서 caspase-3 활성도를 측정하기 위해 caspase-3 activity assay를 진행하였다. 앞선 결과와 마찬가지로 10 µM doxorubicin 처리에 의해 비처리군 대비 138 ± 8.
세포용해액은 원심분리기로 4℃, 13,000 × g 조건에서 10 분간 원심분리 하였고, 단백질 농도를 bradford assay를 이용하여 측정하였다. 총 20 ㎍ 의 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리하였고, 분리된 SDS-PAGE 겔은 thermo scientific pierce G2 fast blotter (Thermo Fisher Scienrific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (GE healthcare life sciences, Chicago, IL, USA)으로 이동시켰다. Membrane은 5% skim milk가 포함된 tris buffered saline + 0.
종합하자면 10 µM doxorubicin 처리에 의해 증가된 HK-2 세포의 necrosis와 미토콘드리아의 과활성은 80 µM cynaroside 전 처리에 의해 감소되었다. 하지만 cynaroside가 doxorubicin에 의한 necrosis를 억제하는 기전과 어떤 신호전달경로를 통해 미토콘드리아의 과활성을 억제하는지 추가적인 실험이 필요할 것이라고 생각되었으며 necrosis로 진행되는 과정 중에 나타나는 DNA 단편화와 necrosis에 관여하는 단백질의 발현량을 조사하였다.
대상 데이터
1 차 항체와 2 차 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)사의 제품인 anti-rabbit igG HRP-linked antibody (#7074), anti-mouse lgG HRP-linked antibody(#7076), PARP (#9532), caspase-3 (#9662), GAPDH(#8884S)를 사용하였다.
(Chengdu, China)에서 파우더 형태로 구입하여 사용하였다. Doxorubicin (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)은 1% dimethyl sulfoxide (DMSO)에 완전히 녹인 후 차광상태로 냉동보관 하고 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 인동덩굴 (Lonicera japonica Thunb.)의 전초에서 분리된 cynaroside (5373-11-5)는 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. (Chengdu, China)에서 파우더 형태로 구입하여 사용하였다. Doxorubicin (Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
일원변량분석 (One-way ANOVA)을 실시하였으며, 유의성이 있는 경우 p < 0.05 수준에서, Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)와 Tukey post-hoc test를 실시하였다.
통계처리는 평균 ± 표준편차 (means ± SD)로 나타내었고, 그룹 간 유의성을 검정하기 위해 SPSS (Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하였다.
이론/모형
HK-2 cells were treated with 10 µM doxorubicin for 24 h. Cell viability was measured by MTS assay. Data represent the means ± SD (n = 3).
Cynaroside의 HK-2 세포에 대한 세포독성과 10 µM doxorubicin으로 유도되는 세포사멸에 대한 세포보호효과를 확인하기 위해 인간 근위세뇨관 세포주인 HK-2 세포를 배양하여 세포생존율을 MTS assay법으로 측정하였다.
Necrosis에 관여하는 인자인 caspase-3와 PARP의 단백질 발현량을 확인하기 위해 western blot을 진행하였다. 10 µM doxorubicin을 24 시간동안 처리했을 때 caspase-3와 PARP의 cleaved form이 증가하였고 80 µM cynaroside 전 처리에 의해 감소되었다 [Fig.
Tunel 염색은 DeadEnd™ fluorometric TUNEL system(Promega Co., Madison, WI, USA)을 사용하였고 키트에서 제공된 protocol에 따라 수행했다.
세포의 생존율은 CellTiter 96® aqueous one solution cell proliferation assay (Promega Co., Madison, WI, USA)를 이용하고 제조사에서 제공한 protocol에 따라 실험을 진행했다.
성능/효과
결과를 종합하면 10 µM doxorubicin 처리는 HK-2세포에서 caspase-3 단백질의 발현량과 활성화, DNA 단편화를 유도하지만 80 µM cynaroside 전 처리에 의해 차단되었다.
다음으로 cynaroside를 농도 의존적으로 1 시간 동안 전 처리하고 10 µM doxorubicin을 HK-2 세포에 24 시간 동안 처리했을 때 doxorubicin 단독처리군은 정상대조군에 비하여 생존율이 73.6 ± 2.0%로 감소되었으며 80 µM cynaroside 처리 군은 90.9 ± 1.0%로 회복되었다 [Fig. 1B].
뿐만 아니라 10 µM doxorubicin 처리 시 증가되는 미토콘드리아 활성은 정상의 red signal이 59.78%인 반면 92.18%까지 높아졌고 80 µM cynaroside 전 처리 시 69.84%까지 감소되었다 [Fig. 2B].
이러한 결과를 바탕으로 doxorubicn에 의한 세포사 억제 효과를 확인해본 결과, doxorubicin 처리에 의한 세포독성은 40 µM cynaroside를 처리했을 때 doxorubicin 단독처리 군에 비교하여 세포생존율이 크게 회복되었다.
이에 근거하여 실험을 진행하였을 때, 본 실험에서도 doxorubicn에 의한 신장세포괴사와 미토콘드리아 과활성이 증가되는 것을 확인하였으며, 80 µM cynaroside에 의해 차단되는 결과로 보아 necrosis를 유도하는 단백질인 PARP1 또는 caspase-3 단백질 활성을 억제할 것으로 생각된다.
종합하자면 10 µM doxorubicin 처리에 의해 증가된 HK-2 세포의 necrosis와 미토콘드리아의 과활성은 80 µM cynaroside 전 처리에 의해 감소되었다.
후속연구
따라서 cynaroside 단독처리는 HK-2 세포에 대해 80 µM 농도까지 세포독성을 나타내지 않았지만 HK-2 세포내에서 세포주기를 조절하는 여러 인자에 어떠한 영향을 미치는지 추가적인 실험이 필요하다고 사료된다.
, 2013). 앞서 언급한 이유 때문에 현재 자연에서 얻을 수 있는 천연분리물질 또는 천연추출물을 이용해 항암에 관련된 여러 연구가 수행되고 있으며 (Choi et al., 2014; Han et al., 2016; Yang et al., 2015), 더 나아가 항암제의 부작용을 줄이면서 항암효능을 증가시킬 수 있는 천연분리물질의 탐색과 연구가 필요하다.
앞서 언급한대로 10 µM doxorubicn은 세포괴사 과정 중 DNA 단편화와 caspase-3 단백질 활성화를 일으키는 것으로 알려져 있으며 (Fink and Cookson, 2005), 지금까지 결과를 종합해봤을 때 cynaroside는 doxorubicn에 의해 유도된 세포괴사를 억제하는 것으로 보아 세포수준에서 신장독성보호효과를 가지고 있다고 생각한다. 하지만 doxorubicin에 의해 유도되는 oxidative stress (산화스트레스)와 necrosis에 작용하는 단백질들의 발현량 또는 활성도와 신장독성을 억제할 수 있는지를 doxorubicin 유도 동물 모델 (in vivo model)에서 확인하는 추가연구가 필요하다고 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
암세포에서 Doxorubicin은 어떤 기작을 유도하는가?
, 2012). 이는 adriamycin으로도 알려져 있으며, 암세포에서 두 가지 기작을 유도하는데, 첫 번째로 DNA 사이에 삽입되어 DNA합성을 방해하고, 두 번째로 topoisomerase-2에 의한 DNA 수리를 방해할 뿐만 아니라 세포 내부에 free radical을 생성해 암세포 내에서 산화스트레스 (oxidative stress) 증가시키고 세포죽음을 유도 한다 (Thorn et al., 2011).
Doxorubicin의 부작용은?
,2007). Doxorubicin도 마찬가지로 심장독성, 위장병, 탈모와 같은 부작용이 수반 된다 (Tacar et al., 2013).
Cynaroside은 무엇인가?
Cynaroside는 luteolin-7-O-glucoside, luteoloside, glucoluteolin 등 여러 가지 이름으로 알려져 있으며, 여러 약용식물에서 발견되는 흔한 flavonoid 성분으로 신선초 (Angelica keiskei)와 인동덩굴 (Lonicera japonica Thunb.)에서 분리되어 효능이 알려져 있다 (Park et al.
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