[논문]방울비짜루 지표성분의 함량분석과 항산화·항염증 활성

이현주; 정다은; 강주은; 심미옥; 성태경; 우경완; 안병관; 정호경; 조현우

[국내논문] 방울비짜루 지표성분의 함량분석과 항산화·항염증 활성
Quantitative Analysis of Chemical Composition and In Vitro Anti-oxidant and Anti-inflammatory Properties of Asparagus oligoclonos 원문보기

생약학회지, v.49 no.2, 2018년, pp.138 - 144

이현주 (한약진흥재단 한약자원본부) , 정다은 (한약진흥재단 한약자원본부) , 강주은 (한약진흥재단 한약자원본부) , 심미옥 (한약진흥재단 한약자원본부) , 성태경 (한약진흥재단 한약자원본부) , 우경완 (한약진흥재단 한약자원본부) , 안병관 (한약진흥재단 한약자원본부) , 정호경 (한약진흥재단 한약자원본부) , 조현우 (한약진흥재단 한약자원본부)

Abstract ▼ AI-Helper

Asparagus oligoclonos is one of the endemic halophytes used folk medicine in Korea. We isolated the main compound rutin from methanol extracts of A. oligoclonos based on nuclear magnetic resonance and TOF ESI-MS data. We have investigated the quantitative analysis method of main compound using HPLC and the results exhibit that rutin content of A.oligoclonos were 1.816%. To explore anti-oxidant from A. oligoclonos ethanol extracts (AOE), we investigated the antioxidant effects of AOE on $H_2O_2$-induced oxidative stress in RAW 264.7 cell. AOE were reduced $H_2O_2$-induced oxidative stress via enhancement of cell viability, and AOE significantly decreased ROS production depending on concentration. Next, to screen for anti-inflammatory activity of AOE, we investigated the inhibitory effects of AOE in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. AOE had no effect on cell viability at a concentration of $500{\mu}g/mL$. Nitric oxide (NO) production inhibited in a dose-dependent manner. These results suggest that AOE may be a useful antioxidant and anti-inflammatory agent.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. Chemical structure of compound 1.
표 Table I. HPLC condition of rutin
그림 Fig. 2. HPLC chromatograms of rutin (A) and EtOH extracts of A. oligoclonos (B).
그림 Fig. 3. Calibration curve of rutin.
표 Table II. The contents of rutin by extraction solvents
표 Table III. The contents of rutin by extraction time and methods
그림 Fig. 4. Effect of AOE on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 5. Effect of AOE on hydrogen dioxide (H₂O₂)-mediated cytotoxicity in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 6. Effect of AOE on hydrogen dioxide (H₂O₂)-mediated ROS induction in RAW 264.7 cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 방울비짜루 전초로부터 지표 성분을 분리하고, 분리된 지표성분의 함량 분석을 진행하였다. 또한, 방울비짜루 에탄올 추출물의 활성을 탐색하기 위해 과산화수소로 유도된 세포독성에서 방울비짜루의 세포보호 효과와 LPS로 유도된 염증반응을 관찰하여 방울비짜루 에탄올 추출물의 염증과 관련된 질환의 예방과 치료를 위한 원료로서 가능성을 타진하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 방울비짜루 전초로부터 지표 성분을 분리하고, 분리된 지표성분의 함량 분석을 진행하였다. 또한, 방울비짜루 에탄올 추출물의 활성을 탐색하기 위해 과산화수소로 유도된 세포독성에서 방울비짜루의 세포보호 효과와 LPS로 유도된 염증반응을 관찰하여 방울비짜루 에탄올 추출물의 염증과 관련된 질환의 예방과 치료를 위한 원료로서 가능성을 타진하고자 하였다.
본 연구에서는 방울비짜루의 지표성분 설정 및 함량 분석법 확립 및 방울비짜루의 항산화 및 항염증 효과를 입증하였다. 향후 동물실험 등 추가적인 유효성 평가와 안전성 연구가 필요하며, 이후 재배단지 구축을 위한 재배법 연구가 추가되어야 한다.

제안 방법

10) 본 연구에서는 방울비짜루 에탄올 추출물이 RAW 264.7 cell에서 NO 생성 저해와 관련된 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 cell에 방울비짜루 에탄올 추출물을 62.5, 125, 250 µg/mL 농도로 처리하고 LPS로 자극하여 NO의 생성 정도를 측정하였다.
30분 후에 hydrogen peroxide 500 µM를 첨가하고 24시간 더 배양하고 MTS assay로 세포 생존율을 측정하였다.
Column chromatography에는 ODS gel(ODS-A, 50 μm, YMC, Japan)을 충진제로 사용하였으며, precoated RP-18 F254S plate(Aluminium sheets, Merck, Germany)를 사용해 TLC분석을 행하였다.
HPLC 분석 조건 − 지표성분 rutin을 Table I과 같은 조건으로 Luna C18(2) column(5 μm, 4.6×250 mm)이 장착된 HPLC를 이용하여 함량 분석을 실시하였다.
Hydrogen Peroxide로 유도된 RAW 264.7 cell에서 방울비짜루 에탄올 추출물의 세포보호효과와 활성산소종(ROS)에 대한 영향 − 방울비짜루 에탄올 추출물이 가지는 세포보호효과를 확인하기 위해 hydrogen peroxide를 RAW 264.7 cell에 처리하여 산화적 스트레스를 유발시켰다.
Hydrogen Peroxide에 의한 세포의 손상으로부터 대식세포보호 효과 측정 − RAW 264.7 cell을 96 well plate에 3×105cells/mL로 100 µL씩 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 시료를 농도 별로 처리하였다.
Nitric oxide(NO) 농도 측정 − LPS로 활성화된 대식세포에서 방울비짜루 에탄올 추출물의 NO 생성억제정도를 측정하였다.
5 μg/mL)으로 희석하여 HPLC 분석하였다. y = ax + b(y: peak 면적, x: 시료농도, a: 직선의 기울기, b: y절편)의 형태로 검량선을 작성하여 직선식의 상관계수를 구해 직선성을 확인하였다.
검량선 및 직선성(Linearity) − 지표물질 rutin의 농도에 따른 측정값을 확인하기 위해 표준용액을 MeOH로 단계적(400, 200, 100, 50, 25.5, 12.5 μg/mL)으로 희석하여 HPLC 분석하였다.
그 중 main compound가 함유된 AOE 3(600 mg)을 Luna C18(2) column(30 mm×250 mm, 5 µm, phenomenex, USA)이 장착된 preparative HPLC(infinity 1260, Agilent, USA)를 이용하여 추가적인 분리를 행하였다.
동일한 방법으로 칭량 후 각각 MeOH 10 mL를 첨가하여 초음파 추출(30분, 30분 2회, 60분, 25oC) 및 환류 추출(30분, 30분 2회, 60분)하고 syringe filter(0.2μm, Advantec, Japan)로 여과 후 사용하였다.
방울비짜루의 전초로부터 column chromatography와prepHPLC를 이용하여 주성분인 화합물 1을 분리하였고, 분리된 화합물을 ¹H, ¹³C NMR과 LC IT TOF MS 분석을 통해 rutin으로 구조동정하였다. 지표물질의 함량분석을 위한 추출 및 HPLC 분석조건을 확립한 결과, 50% MeOH, 초음파 30분 추출 시 1.
본 연구에서는 hydrogen peroxide에 의해 유도된 활성산소종(ROS)을 DCFH-DA를 이용해 측정하였다. Hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포들은 정상군에 비하여 유의하게 ROS-positive cell이 증가하였고 방울비짜루 에탄올 추출물을 62.
Anisaldehyde(Sigma Aldrich, USA)를 발색시약으로, methanol-d₄(Sigma Aldrich, USA)를 NMR용매로 사용하였다. 세포실험을 위한 추출물은 환류추출기(MS-DM609) 및 동결건조기(일신, 본디로 LYOPH-PRIDE 20R)를 이용하여 제조하였다. 세포 배양에 사용된 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), penicillin-streptomycin(P/S), fetal bovine serum(FBS) 및 phosphate-buffered saline(PBS)는 Gibco(Grand Island, USA, NY)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS)는 CellTiter 96® AQueous one solution cell proliferation assay와 Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
유세포 분석기를 이용한 ROS 측정 − LPS로 활성화된 대식세포 배양액을 활성산소와 반응하여 형광을 발산하는 DCF-DA를 이용해 유세포분석기(Flow Cytometry, BD Biosciences, Billerica, MA, USA)로 측정하였다.
지표물질 분리 − ODS gel(50 μm, YMC, Japan) 250 g이 충진된 glass column(8 cm×60 cm)에 Ethyl acetate 분획물(3 g)을 charge시킨 후 0.02% formic acid를 함유한 H2O과 ACN 혼합용매(90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 0:100)를 이동상으로 gradient 용출법에 의해 분획하였다.
지표성분 구조 분석 − 지표물질은 노란색 가루로, TLC분석에서 Anisaldehyde 발색 시약을 분무하여 가열하였을 때 노란 반점을 나타내어 flavonoid로 추정하였다.
추출 및 분획 − 방울비짜루 전초 2 kg에 methanol을 가하여 3시간 동안 3회 환류 추출하였고, 농축하여 메탄올 추출물 267 g을 얻었다.
표준용액 조제 − 방울비짜루로부터 정제한 지표물질 rutin 2 mg에 MeOH 5 mL를 가하여 stock solution을 조제하였고, 단계별로 희석하여 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ppm의 표준용액을 조제하였다.
함량분석 − 방울비짜루로부터 분리한 지표물질 rutin의 분석법 확립을 위해 Table I과 같은 조건으로 HPLC 분석을 행하였다.
Column chromatography에는 ODS gel(ODS-A, 50 μm, YMC, Japan)을 충진제로 사용하였으며, precoated RP-18 F_254S plate(Aluminium sheets, Merck, Germany)를 사용해 TLC분석을 행하였다. 함량분석을 위해 LC-20AD pump, CTO-20A column oven, DGU-20A₅ degasser, SPD-M20A UV detector, SIL-20A autoinjector로 구성된 HPLC system(Shimadzu, Japan)에 Luna C18(2) column(Phenomenex, USA)을 장착하여 사용하였다. Anisaldehyde(Sigma Aldrich, USA)를 발색시약으로, methanol-d₄(Sigma Aldrich, USA)를 NMR용매로 사용하였다.

대상 데이터

2',7'-dichlorofluoresceindiacetate(DCF-DA)는 Sigma Aldrich(USA)에서 구매하였고 그 외의 모든 실험에서 사용된 시약들은 일급 및 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
함량분석을 위해 LC-20AD pump, CTO-20A column oven, DGU-20A₅ degasser, SPD-M20A UV detector, SIL-20A autoinjector로 구성된 HPLC system(Shimadzu, Japan)에 Luna C18(2) column(Phenomenex, USA)을 장착하여 사용하였다. Anisaldehyde(Sigma Aldrich, USA)를 발색시약으로, methanol-d₄(Sigma Aldrich, USA)를 NMR용매로 사용하였다. 세포실험을 위한 추출물은 환류추출기(MS-DM609) 및 동결건조기(일신, 본디로 LYOPH-PRIDE 20R)를 이용하여 제조하였다.
7)는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, Seoul)으로부터 분양 받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS와 1% P/S이 첨가 된 DMEM 배지에서 37^oC, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.
90’12’’E)에서 채취하였다. 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수에게 의뢰하여 동정하여 실험에 이용하였고, 표본(표본번호: TKM-2109)은 한약진흥재단 한약재연구팀에서 보관하였다.
분획된 각 획분을 TLC로 스크리닝하여 동일 Rf value를 갖는 6개의 소분획물을 얻었다(AOE 1-6).
세포 배양에 사용된 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), penicillin-streptomycin(P/S), fetal bovine serum(FBS) 및 phosphate-buffered saline(PBS)는 Gibco(Grand Island, USA, NY)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS)는 CellTiter 96® AQueous one solution cell proliferation assay와 Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
세포배양 − 대식세포(RAW 264.7)는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, Seoul)으로부터 분양 받아 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 이용한 방울비짜루는 2015년 4월에 전남 장흥(34.62’90’’N, 126.90’12’’E)에서 채취하였다.
그 중 main compound가 함유된 AOE 3(600 mg)을 Luna C₁₈(2) column(30 mm×250 mm, 5 µm, phenomenex, USA)이 장착된 preparative HPLC(infinity 1260, Agilent, USA)를 이용하여 추가적인 분리를 행하였다. 이동상은 H₂O(containing 0.02% formic acid, A)와 Acetonitrile(B)을 이용하였으며, A 용액을 시작 용출 용매로 하여 30분 후 B가 30%가 되도록 하였다. 검출은 254 nm 파장에서, 유속은 25 mL/min, column 온도는 실온의 조건에서 화합물 1(31 mg)을 분리하였다(Fig.

데이터처리

Significant differences between treated groups were determined using the Student’s t-test.
Significant differences were determined using the Student's t-test.
또한 SPSS(Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 Student’s t-test로 분석하여 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.
통계처리 − 본 실험에서 얻은 결과를 3회 이상 반복 측정하여 평균±표준편차(mean±S.D)로 나타내었다.

이론/모형

배양액 중에 분비된 NO의 농도를 Griess 반응법으로 측정하였고 96 well plate의 각 well에서 세포배양액 100µL와 Griess 용액(1% sulfanilamide in 5% HCl과 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride를 1:1로 혼합) 100 µL를 넣고 20분간 반응시켜 ELISA microplate reader(Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포독성(Cell Cytotoxicity) 측정 − 방울비짜루 에탄올 추출물의 세포독성은 MTS assay를 실시하여 측정하였다.

성능/효과

¹⁴⁾ 또한, hydrogen peroxide로 유도된 산화적 스트레스 반응에서 항산화와 관련된 효소의 활성을 증가시켜 세포 내 ROS 생성을 억제하고,¹⁵⁾ 자유라디칼 소거능이 뛰어난 강력한 항산화제 중 하나로 알려져 있다.¹³⁾ 따라서, 본 연구에서 방울비짜루 에탄올 추출물이 가지는 항산화 및 항염증 효능은 지표성분인 rutin이 크게 기여했을 것으로 사료된다.
⁹⁾ 방울비짜루의 지표성분인 rutin 역시 50% MeOH에서 추출 효율이 가장 높았다. 50% MeOH, 30분 초음파 추출로 지표성분의 함량을 구한 결과, 방울비짜루의 rutin 함량은 1.816%로 나타났다.
많은 flavonoid는 유기용매에 잘 용해되지만 flavonoid glycoside와 같이 극성이 높은 flavonoid는 물-유기용매 혼합용매에 더 잘 용해되는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 방울비짜루의 지표성분인 rutin 역시 50% MeOH에서 추출 효율이 가장 높았다. 50% MeOH, 30분 초음파 추출로 지표성분의 함량을 구한 결과, 방울비짜루의 rutin 함량은 1.
지표성분 구조 분석 − 지표물질은 노란색 가루로, TLC분석에서 Anisaldehyde 발색 시약을 분무하여 가열하였을 때 노란 반점을 나타내어 flavonoid로 추정하였다. ESI IT-TOF MS spectra에서 분자량 m/z 611 [M+H]⁺을 확인하였고, MS/MS 분석에서 m/z 465 [M-rhamnose+H]⁺, m/z 303 [Mrhamnose-glucose+H]⁺을 추가로 확인하였으며, rutin 표준품과 retention time 및 MS/MS 패턴이 정확하게 일치함을 확인하였다. 또한 ¹H-NMR spectrum에서 flavonoid A-ring에 귀속되는 2종의 proton signal들[δ 6.
Hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포들은 정상군에 비하여 유의하게 ROS-positive cell이 증가하였고 방울비짜루 에탄올 추출물을 62.5, 125, 250 µg/mL의 농도로 세포를 처리하였을 때 농도의존적으로 세포 내 활성산소종(ROS)을 완화시키는 것을 확인할 수 있었다.
함량분석 − 방울비짜루로부터 분리한 지표물질 rutin의 분석법 확립을 위해 Table I과 같은 조건으로 HPLC 분석을 행하였다. 그 결과 21.4 min에서 rutin을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 지표물질의 표준용액은 12.
5, 125, 250 µg/mL 농도로 처리하고 LPS로 자극하여 NO의 생성 정도를 측정하였다. 그 결과 LPS만 처리한 군이 LPS를 처리하지 않은 정상군에 비해 NO 생성량이 현저하게 증가하였으며, 방울비짜루 에탄올 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 NO의 생성이 억제되었다. 방울비짜루 에탄올 추출물이 NO 생성을 억제함에 따라 항염증 소재로의 이용가능성을 확인하였다(Fig.
Hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포는 정상군에 비하여 유의하게 세포생존율이 감소하였고, 방울비짜루 에탄올 추출물이 농도의존적으로 세포 생존률을 증가시켰다. 따라서 방울비짜루 에탄올 추출물이 hydrogen peroxide에 유도된 산화적 스트레스를 감소시켜 세포보호효과가 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 5).
방울비짜루 에탄올 추출물의 항염증활성을 탐색하기 위해 RAW 264.7 cell에 방울비짜루 에탄올 추출물(62.5, 125, 250 µg/mL)과 LPS를 처리하여 24시간 배양한 뒤 NO생성을 측정한 결과, 세포독성 없이 유의적으로 NO 생성을 억제하였다.
그 결과 LPS만 처리한 군이 LPS를 처리하지 않은 정상군에 비해 NO 생성량이 현저하게 증가하였으며, 방울비짜루 에탄올 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 NO의 생성이 억제되었다. 방울비짜루 에탄올 추출물이 NO 생성을 억제함에 따라 항염증 소재로의 이용가능성을 확인하였다(Fig. 4).
위의 data를 기존문헌7,8)과 비교하여 quercetin에 비해 C-3(δ 135.8)의 고자장 shift, C-6"(δ 68.7)의 저자장 shift를 통해 quercetin의 3위에 rutinose가 결합함이 재차 확인되었고, 화합물 1을 rutin으로 구조 동정하였다(Fig. 1).
5, 125, 250 µg/mL의 농도로 세포를 처리하였을 때 농도의존적으로 세포 내 활성산소종(ROS)을 완화시키는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 방울비짜루 에탄올 추출물이 ROS 생성을 억제하고 세포독성을 완화시켜 항산화 활성이 있음을 확인하였다(Fig. 6).
C NMR과 LC IT TOF MS 분석을 통해 rutin으로 구조동정하였다. 지표물질의 함량분석을 위한 추출 및 HPLC 분석조건을 확립한 결과, 50% MeOH, 초음파 30분 추출 시 1.816%로 추출 효율이 가장 높은 것으로 확인되었다.
3). 추출 용매에 따른 지표성분 함량 비교 결과 50% MeOH 추출 시 가장 높은 효율을 보였고(Table II), 추출조건에 따른 함량분석 결과 30분 초음파 추출 시 가장 효율이 높음을 확인하였다(Table III). 많은 flavonoid는 유기용매에 잘 용해되지만 flavonoid glycoside와 같이 극성이 높은 flavonoid는 물-유기용매 혼합용매에 더 잘 용해되는 것으로 알려져 있다.

후속연구

5, 125, 250 µg/mL)과 LPS를 처리하여 24시간 배양한 뒤 NO생성을 측정한 결과, 세포독성 없이 유의적으로 NO 생성을 억제하였다. RAW 264.7 cell에 hydrogen peroxide로 유도한 산화적 스트레스를 방울비짜루 에탄올 추출물이 농도의존적으로 완화시켰고, 활성산소종이 유의적으로 감소함이 관찰됨에 따라 토종자원 중 염생식물 유래 항염증 및 항산화 소재로써 효과적인 활용이 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 방울비짜루의 지표성분 설정 및 함량 분석법 확립 및 방울비짜루의 항산화 및 항염증 효과를 입증하였다. 향후 동물실험 등 추가적인 유효성 평가와 안전성 연구가 필요하며, 이후 재배단지 구축을 위한 재배법 연구가 추가되어야 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염생식물에는 어떠한 것들이 있는가?	염생식물(Halophyte)은 식물의 생장을 저해하는 염분 농도가 높은 토양에서 잘 적응하여 생육하고 있는 식물로 염 적응에 관련된 형태학적 특성과 체내 염분을 효과적으로 제거 하는 생리적 기작을 가지고 있다. 이러한 염생식물은 우리나라에 16과 40여종이 보고되고 있으며,1) 대표적인 종으로는 함초, 칠면초, 번행초, 나문재, 해홍나물, 갯방풍 등이 있다. 최근 염생식물들의 혈중 콜레스테롤 및 혈중 지질 감소, 항산화 효과 등 다양한 기능성이 과학적으로 밝혀지면서 이를 찾는 소비자가 늘고있어 대규모 재배 농장이 생겨나고 있다.
	염생식물의 특징은 무엇인가?	염생식물(Halophyte)은 식물의 생장을 저해하는 염분 농도가 높은 토양에서 잘 적응하여 생육하고 있는 식물로 염 적응에 관련된 형태학적 특성과 체내 염분을 효과적으로 제거 하는 생리적 기작을 가지고 있다. 이러한 염생식물은 우리나라에 16과 40여종이 보고되고 있으며,1) 대표적인 종으로는 함초, 칠면초, 번행초, 나문재, 해홍나물, 갯방풍 등이 있다.
	염생식물은 어떻게 사용되는가?	최근 염생식물들의 혈중 콜레스테롤 및 혈중 지질 감소, 항산화 효과 등 다양한 기능성이 과학적으로 밝혀지면서 이를 찾는 소비자가 늘고있어 대규모 재배 농장이 생겨나고 있다. 주로 생식하거나 나물 등의 형태로 먹어왔으나 최근에는 환, 발효액, 소금, 된장 등 식품 및 기능성 제품들이 개발되어 판매되고 있다.2)

참고문헌 (15)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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