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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 폐기되는 꽃송이버섯 기부를 발효하고 장어에 사료 첨가제로 급이하여 생장률, lysozyme 용균 활성, 혈청 살균능을 분석하여 면역증진 효능 및 활용 가능성을 검토하였다.
- 꽃송이버섯은 버섯의 갓 부분에 해당하는 자실체(pileus)와 자실체를 제외한 부분에 해당하는 기부(stipe)로 구성되어 있지만, 실제 식용으로 활용되는 부위는 자실체에 한정되어 있으며, 꽃송이버섯 기부는 대부분 폐기되고 있다. 본 연구팀은 이전 연구에서 꽃송이버섯 자실체와 기부의 성분 분석과 면역조절능 검증을 통해 꽃송이버섯 기부의 활용 가능성을 제시하였다(19).
제안 방법
- subtilis 발효 실험구는 큰 차이를 보이지 않았다. DPPH 라디칼 소거 활성은 L. plantarum이 63.9%로 가장 우수한 항산화 활성을 보여 L. plantarum을 이용하여 꽃송이버섯 기부를 발효한 후 장어에 사료 첨가제로 급이하였다. 6주간 장어의 폐사는 대조구에서 60마리로 가장 많은 폐사를 보였으며, 꽃송이버섯 기부 추출물이 24마리로 가장 적은 폐사를 보였다.
- coli를 tryptic soy agar (TSA) 배지에 배양(37℃, 24 h)한 후 백금이를 이용하여 멸균생리식염수와 1 μg/mL로 희석하였다. 그 후 0.005 M PBS에 1:4로 희석된 혈청 희석액과 1:1로 혼합한 후 0, 1, 3, 6, 24시간 간격으로 TSA 배지에 계대배양 하여 생균수를 측정하였다.
- 대조구로는 꽃송이버섯 기부 추출물을 사용하였다. 꽃송이버섯 기부 발효물의 생균수는 발효 0, 24, 48, 72시간별로 측정하였으며, 측정방법은 흡광광도계(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 활용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 꽃송이버섯 기부 발효물의 총 페놀 함량은 Folin-Denis법(23)을 변형하여 측정하였다. 시료 0.
- 꽃송이버섯 기부 발효에 적합한 균주를 선발하기 위해 발효 기간별 생균수를 600 nm의 흡광도에서 측정하였다(Fig. 1). 발효 초기(0시간)의 흡광도는 0.
- 꽃송이버섯 기부의 열수 추출은 꽃송이버섯 기부 분말에 20배의 증류수를 첨가하고 고압멸균기에서 고압 추출(121 ℃, 30 min)하였으며, 추출 후 원심분리(2,500 rpm, 15 min)하여 상등액을 분리하여 사용하였다. 꽃송이버섯 기부 추출물에 각각의 균주를 1% 접종하여 37℃ incubator에서 72시간 발효를 진행하였다. 대조구로는 꽃송이버섯 기부 추출물을 사용하였다.
- 실험 사료 공급은 1일 2회(05:00, 17:00)로 나누어 6주간 만복 공급을 실시하였다. 대조구로 사용된 장어는 시중에 판매되는 배합사료만 공급하였으며, 실험구는 꽃송이버섯 기부 추출물과 L. plantarum을 이용하여 37℃에서 72시간 발효한 꽃송이버섯 기부 발효물을 배합사료 대비 1% 첨가하여 배합사료와 혼합 후 공급하였다. 동물실험은 동신대학교 동물실험윤리 위원회의 승인을 받아 수행하였다(동물실험 승인번호: 2017- 06-01).
- 장어의 혈청은 Kim 등(25)의 방법을 변형하여 수집하였다. 사육 6주차의 장어를 수조에서 분리하고 얼음으로 마취시킨 뒤 어미에서 약 1 cm 떨어진 부위를 멸균된 가위로 절단하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 1시간 동안 실온에서 방치 후 원심분리 (6,000 rpm, 10 min) 하여 혈청을 분리하였으며, 분리된 혈청은 -20℃에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.
- 3으로 유지하였다. 실험 사료 공급은 1일 2회(05:00, 17:00)로 나누어 6주간 만복 공급을 실시하였다. 대조구로 사용된 장어는 시중에 판매되는 배합사료만 공급하였으며, 실험구는 꽃송이버섯 기부 추출물과 L.
- plantarum은 발효과정 중 Fe2+을 제거하여 강력한 hydroxyl 라디칼 소거 활성을 보여 항산화 효과가 증가하는 것으로 알려져 있다(38). 이상의 결과를 종합했을 때 가장 빠른 발효속도와 우수한 항산화 활성을 보인 L. plantarum을 장어 사육실험의 균주로 선택하였고, 이를 이용하여 꽃송이버섯 기부 추출물을 발효하여 장어에 급이하고 효능을 검토하였다.
- 장어의 비특이적 면역분석은 혈청 내 lysozyme activity와 Escherichia coli 살균능을 측정하였다. 혈청 내 lysozyme activity는 Micrococcus lysodeikticus(Sigma-Aldrich Co.
- 장어의 세균성 감염에 대한 저항성을 측정하기 위해 E. coli 살균능을 측정하였다. 꽃송이버섯 기부 추출물과 발효물을 급이한 장어의 혈청 살균능 결과를 Fig.
- 폐사율은 실험 기간 동안 폐사한 장어를 개수하여 전체 장어 대비 폐사한 비율을 측정하였다. 장어의 혈청은 Kim 등(25)의 방법을 변형하여 수집하였다. 사육 6주차의 장어를 수조에서 분리하고 얼음으로 마취시킨 뒤 어미에서 약 1 cm 떨어진 부위를 멸균된 가위로 절단하여 혈액을 채취하였다.
- 전자소거능은 (%)은 100－[(O.D of sample/O.D of control)×100]에 의하여 활성도를 산출하였다.
- 폐사율은 실험 기간 동안 폐사한 장어를 개수하여 전체 장어 대비 폐사한 비율을 측정하였다. 장어의 혈청은 Kim 등(25)의 방법을 변형하여 수집하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 재료는 꽃송이버섯 기부만 사용하였으며, 분리된 꽃송이버섯 기부는 열풍 건조(40℃, 24 h)한 후 분쇄하여 사용하였다. 꽃송이버섯 기부 발효에 사용된 균주는 각각 Lactobacillus plantarum KCCM 11322(KCCM, Seoul, Korea), Saccharomyces cerevisiae K1-V1116(Lallemand Inc., Montreal, Canada), Bacillus subtilis KCTC 1021(KCTC, Jeongeup, Korea)이었으며, L. plantarum은 37℃에서 48시간, S. cerevisiae는 30℃에서 48시간 전배양 하였으며, B. subtilis는 30℃에서 48시간 진탕 전배양 한 후 종균으로 첨가하였다.
- 꽃송이버섯은 2016년 백아산꽃송이버섯 영농조합법인(Hwasun, Korea)에서 재배된 것을 생물상태로 구입하여 자실체와 기부로 분리하였다. 실험에 사용된 재료는 꽃송이버섯 기부만 사용하였으며, 분리된 꽃송이버섯 기부는 열풍 건조(40℃, 24 h)한 후 분쇄하여 사용하였다.
- 꽃송이버섯 기부 추출물에 각각의 균주를 1% 접종하여 37℃ incubator에서 72시간 발효를 진행하였다. 대조구로는 꽃송이버섯 기부 추출물을 사용하였다. 꽃송이버섯 기부 발효물의 생균수는 발효 0, 24, 48, 72시간별로 측정하였으며, 측정방법은 흡광광도계(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 활용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험어(장어)는 자이아쿠아팜(Naju, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 장어는 A.
- 꽃송이버섯은 2016년 백아산꽃송이버섯 영농조합법인(Hwasun, Korea)에서 재배된 것을 생물상태로 구입하여 자실체와 기부로 분리하였다. 실험에 사용된 재료는 꽃송이버섯 기부만 사용하였으며, 분리된 꽃송이버섯 기부는 열풍 건조(40℃, 24 h)한 후 분쇄하여 사용하였다. 꽃송이버섯 기부 발효에 사용된 균주는 각각 Lactobacillus plantarum KCCM 11322(KCCM, Seoul, Korea), Saccharomyces cerevisiae K1-V1116(Lallemand Inc.
- 실험어(장어)는 자이아쿠아팜(Naju, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 장어는 A. bicolor를 필리핀에서 수입하여 시판 배합사료를 공급하여 약 3주간의 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 장어의 초기 평균 무게는 6.
데이터처리
- 모든 실험은 3반복하였으며, SPSS Statistics 22.0 Version(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 일원배치 분산분석(ANOVA)을 실시하였고, Duncan’s multiple range test를 통해 95%의 신뢰 수준(P<0.05)에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 반응물은 750 nm에서 흡광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 표준 곡선은 gallic acid를 이용하여 작성하였다. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정은 Blois(24)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 0.
성능/효과
- plantarum을 이용하여 꽃송이버섯 기부를 발효한 후 장어에 사료 첨가제로 급이하였다. 6주간 장어의 폐사는 대조구에서 60마리로 가장 많은 폐사를 보였으며, 꽃송이버섯 기부 추출물이 24마리로 가장 적은 폐사를 보였다. 장어 혈청의 lysozyme 용균 활성 및 E.
- 2에 나타내었다. L. plantarum과 S. cerevisiae로 발효한 실험구의 총 페놀 함량이 각각 301.68 ppm, 299.35 ppm으로 대조구에 비해 약 25.44 ppm(L. plantarum), 23.11 ppm(S. cerevisiae) 증가한 결과를 보였다. 그중 가장 높은 총 페놀 함량을 보인 L.
- 9%의 활성을 보여 모든 균주에서 발효를 통해 꽃송이버섯 기부의 항산화 활성이 증가한 값을 나타내었다. 균주별로 살펴보면 L. plantarum으로 발효한 실험구가 63.9%로 가장 높은 활성을 나타내어 대조군과 유의적 차이를 보였고, S. cerevisiae(60.2%), B. subtilis(58.5%)로 발효한 실험구는 발효 전의 대조군과 유의적 차이는 없었다. 유산균 발효에 의한 버섯 추출물의 항산화 활성을 연구한 Yang 등(37)은 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯이 유산균 발효 때문에 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, Park 등 (35)의 연구 결과에서도 꽃송이버섯을 유산균 발효하였을 때 항산화 활성이 증가하는 결과를 보여 본 연구의 L.
- 420의 흡광도를 보여 모든 균주가 꽃송이버섯 기부 추출물의 환경에서 영양물질의 공급 없이도 안정적으로 발효를 진행하는 것으로 나타났다. 균주에 따른 생균수는 L. plantarum이 발효 24시간에 1.388로 발효 초기보다 1.080 증가한 흡광도를 보였으며, 48시간 경과 후에는 1.486으로 가장 높은 생균수를 보였다가 이후 감소하여 72시간에는 1.310의 흡광도를 보였다. 이러한 결과는 L.
- 4에 나타내었다. 꽃송이버섯 기부 추출물 및 발효물을 사료 첨가제로 급이한 양식 수조에서는 6주간 폐사가 각각 24마리와 30마리로 일반 배합사료만 공급한 대조구의 60마리에 비해 낮은 폐사율을 보였다. Jeon 등(41)은 김치 유산균 배양물을 배합사료에 첨가하여 넙치에게 공급하고 생존율을 측정했을 때 유산균에 의한 효과를 보이지 않았다고 보고하고 있어 본 연구 결과와는 대조적이지만, 유산균 등의 생균제 급이는 면역증진에 효능을 보인다고 알려져 있다(21).
- plantarum으로 발효시킨 실험구가 발효 시작 후 24시간 동안 대수기(exponential phase)에 이르러 가장 활발한 발효를 보이며 48시간까지 성장하였다가, 이후 정체기(stationary phase) 및 사멸기(death phase)에 이른 결과로 판단된다. 꽃송이버섯 기부 추출물을 S. cerevisiae와 B. subtilis로 발효한 실험구의 경우 발효 시작 후 24시간 동안 급격히 증가하여 L. plantarum과 유사한 패턴을 보였고, B. subtilis의 경우 발효 72시간까지도 생균수가 증가하는 결과를 보였다. 꽃송이버섯 기부 발효물을 장어에 급이할 경우 생균제의 기능을 갖기 위해서는 최소 24시간 이상 발효가 필요할 것으로 생각되며, 이때 꽃송이버섯 기부 발효물의 생균수는 log 8 CFU/mL 이상이었다(data not shown).
- coli에 대한 혈청 살균능은 꽃송이버섯 추출물을 급이한 실험구에서만 유의적인 차이를 보였지만 꽃송이버섯이 장어의 폐사율 감소에는 꽃송이버섯 추출물과 발효물을 급이한 실험구에서 모두 감소된 값을 보였다. 따라서 폐기되고 있는 꽃송이버섯 기부 추출물 및 발효물의 급이는 장어의 비특이적 면역 활성의 증진에 효과적인 것으로 판단되며, 이는 수입산 장어의 집단 폐사 방지에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 3에 나타내었다. 발효 전의 항산화 활성은 52.6%였으며, 발효 72시간 이후 58.5~ 63.9%의 활성을 보여 모든 균주에서 발효를 통해 꽃송이버섯 기부의 항산화 활성이 증가한 값을 나타내었다. 균주별로 살펴보면 L.
- 1). 발효 초기(0시간)의 흡광도는 0.308이었으며, 24시간 경과 후 1.112~1.388로 급격한 증가를 했고 발효 종료 후 (72시간)에는 1.310~1.420의 흡광도를 보여 모든 균주가 꽃송이버섯 기부 추출물의 환경에서 영양물질의 공급 없이도 안정적으로 발효를 진행하는 것으로 나타났다. 균주에 따른 생균수는 L.
- 또한, 꽃송이버섯이 함유한 1,3-β-glucan은 비장 세포를 자극하여 TNF-α, IFN-γ와 같은 사이토킨 생성을 자극하며, 인간과 동물의 면역체계에서 백혈구와 관련된 면역계를 활성화하는 것으로 알려져 있다(19,42,43). 본 연구 결과 대조구 수조보다 실험수조의 장어 폐사가 감소한 것은 이러한 꽃송이버섯의 효과로 보이며, 꽃송이버섯 발효물 급이를 통해 폐사율 감소에 더 영향을 주지는 않는 것으로 보인다. 꽃송이버섯을 발효시키는 것이 장어의 폐사율 감소에 영향을 주는지 명확하게 규명하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 폐기되고 있는 꽃송이버섯 기부 발효에 적합한 균주 선발을 위해 Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis를 활용하여 발효를 진행하였으며, 생균수 실험 결과 L. plantarum이 발효 48시간에 1.486의 흡광도를 보여 빠른 발효속도와 생육능을 보였다. 총 페놀 함량은 L.
- 310의 흡광도를 보였다. 이러한 결과는 L. plantarum으로 발효시킨 실험구가 발효 시작 후 24시간 동안 대수기(exponential phase)에 이르러 가장 활발한 발효를 보이며 48시간까지 성장하였다가, 이후 정체기(stationary phase) 및 사멸기(death phase)에 이른 결과로 판단된다. 꽃송이버섯 기부 추출물을 S.
- 5에 나타내었다. 일반 배합사료를 급이한 장어의 lysozyme 용균 활성은 12.33 unit으로 가장 낮은 활성을 보였으며, 꽃송이버섯 발효물을 급이한 실험구가 54.66 unit으로 가장 높은 활성을 보여, 유산균 발효가 장어의 lysozyme 용균 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. βGlucan을 넙치에 투여한 Kim 등(45)의 연구에서는 βglucan 함량에 따라 lysozyme의 활성이 높아진 결과를 보였고, Jhon 등(46)의 연구에서는 한약재를 기질로 배양한 유산균 첨가가 넙치의 lysozyme의 활성에 긍정적인 효과를 보이는 것으로 보고하고 있다.
- 6에 나타내었다. 일반 배합사료만을 공급한 대조구의 혈청을 첨가하여 E. coli를 배양한 경우 24시간 경과 후 생균수는 7.20 log CFU/mL로 가장 많은 생균수를 보였고, 꽃송이버섯 기부 발효물을 급이한 실험구는 7.11 log CFU/mL였으며, 꽃송이버섯 기부 추출물을 급이한 실험구는 6.75 log CFU/mL로 가장 적은 E. coli 생균수를 보였다. Park 등(47)은 버섯의 추출물이 E.
- 장어 혈청의 lysozyme activity는 꽃송이버섯 발효물을 급이한 실험구에서만 효능을 보였으며, E. coli에 대한 혈청 살균능은 꽃송이버섯 추출물을 급이한 실험구에서만 유의적인 차이를 보였지만 꽃송이버섯이 장어의 폐사율 감소에는 꽃송이버섯 추출물과 발효물을 급이한 실험구에서 모두 감소된 값을 보였다. 따라서 폐기되고 있는 꽃송이버섯 기부 추출물 및 발효물의 급이는 장어의 비특이적 면역 활성의 증진에 효과적인 것으로 판단되며, 이는 수입산 장어의 집단 폐사 방지에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 6주간 장어의 폐사는 대조구에서 60마리로 가장 많은 폐사를 보였으며, 꽃송이버섯 기부 추출물이 24마리로 가장 적은 폐사를 보였다. 장어 혈청의 lysozyme 용균 활성 및 E. coli 살균능은 꽃송이버섯 기부 추출물과 발효물 모두 대조구에 비해 높은 활성을 보였다.
- 486의 흡광도를 보여 빠른 발효속도와 생육능을 보였다. 총 페놀 함량은 L. plantarum과 S. cerevisiae를 활용하여 발효한 실험구에서 301.68 ppm, 299.35 ppm으로 발효 전보다 높은 함량을 보였으며, B. subtilis 발효 실험구는 큰 차이를 보이지 않았다. DPPH 라디칼 소거 활성은 L.
후속연구
- plantarum은 tannase, p-coumaric acid decarboxylase (PAD), benzyl alcohol dehydrogenase의 일부 페놀 화합물 분해 효소에만 유전적으로 특성화된 반면, 대부분의 페놀 화합물에 대한 효소 활성은 생화학적으로 밝혀지지 않았다고 보고하고 있다. L. plantarum이 일부 페놀성 화합물을 분해하는 대사 능력은 갖추고 있지만, 발효 결과 총 페놀 함량과 항산화 효과가 증가하는지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 본 연구 결과 대조구 수조보다 실험수조의 장어 폐사가 감소한 것은 이러한 꽃송이버섯의 효과로 보이며, 꽃송이버섯 발효물 급이를 통해 폐사율 감소에 더 영향을 주지는 않는 것으로 보인다. 꽃송이버섯을 발효시키는 것이 장어의 폐사율 감소에 영향을 주는지 명확하게 규명하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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