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문제 정의
- 본 연구에서는 합환피 물추출물의 인지 및 기억력 개선 효과를 약물 단독 또는 scopolamine으로 유도된 기억력 손상 모델을 이용하여 확인하였고, 유의적인 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 합환피의 인지 능력 및 기억력 향상에 대한 효과를 확인하기 위하여 정상 마우스 및 scopolamine을 처리한 기억력 손상 마우스 모델을 이용하여 행동 실험을 실시하였다. 행동실험으로는 전기 자극을 주는 수동회피실험과 Y-미로실험, 수중미로실험을 수행하였고, 이를 통해 합환피 물추출물이 유의적으로 인지 및 기억력을 향상시킨다는 사실을 관찰하였다.
제안 방법
- 5mA의 전기 충격이 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 되고 mouse는 이를 기억하게 되는데 이 때 길로틴문(gillotin door)이 열린 후 mouse가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다(학습시험; training trial). 학습시험(training trial)이 끝난 후, 24시간 후에 장기기억에 미치는 합환피 추출물의 효과를 확인하고자 실시하였다(기억시험; test trial). 실험동물을 왕복상자에 넣고 10초 동안 탐색시간 후 길로틴문(gillotin door)이 열리고 어두운 쪽으로 mouse의 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time; 머무름 시간)을 180초까지 측정하였다.
- 본 연구에서는 합환피의 인지 능력 및 기억력 향상에 대한 효과를 확인하기 위하여 정상 마우스 및 scopolamine을 처리한 기억력 손상 마우스 모델을 이용하여 행동 실험을 실시하였다. 행동실험으로는 전기 자극을 주는 수동회피실험과 Y-미로실험, 수중미로실험을 수행하였고, 이를 통해 합환피 물추출물이 유의적으로 인지 및 기억력을 향상시킨다는 사실을 관찰하였다.
대상 데이터
- Morris water maze를 통한 공간학습 및 인지력 개선에 대한 실험으로 기억력 관련 스크리닝의 한 방법으로 알려져 있다. 본 maze의 재원은 지름 90cm, 높이 45cm이며 플랫폼(white platform)의 지름은 6cm로 구성되어 있다. 실험방법으로는 maze 에 물의 높이가 30cm가 되도록 물을 채우고 마우스가 플랫폼을 볼 수 없도록 물 높이의 1cm 밑에 설치하였다.
- 본 실험에 사용한 scopolamine과 tacrine (9-amino-1, 2, 3,4-tetrahydroacridine hydrochloride), (-) scopolaminehydrobromide, acetylthiocholine iodide and DTNB (5,5’-dithiobis [2-nitrobenzoic acid])는 시그마(Sigma, USA)의 제품을 사용하였으며 나머지 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 합환피는 ㈜옴니허브에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 합환피를 증류수로 2회 세척하고 분쇄한 후, 합환피 무게의 10배 부피만큼 물을 가한 후 100℃에서 4시간 동안 전탕한 뒤 여과하였다.
- 실험동물은 수컷의 ICR mouse 5주령을 주식회사 오리엔트(경기도, 한국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 대구한의대학교 동물실에서 7일간 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 각 군당 10마리로 구성하였고, 온도 23 ± 3℃, 습도 50 ± 10% 내외, 명암주기 12시간 주기로 일정하게 유지하였다.
- 모든 실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회 승인을 얻어 시행하였으며, 동물 관리 규정을 준수하였다(DHU 2016-079). 실험동물은 수컷의 ICR mouse 5주령을 주식회사 오리엔트(경기도, 한국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 대구한의대학교 동물실에서 7일간 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 매일 첫 번째 입수 30분 전에 건망증 유발물질로 스코폴라민(scopolamine) 1 mg/kg을 복강으로 투여하였다. 모든 실험은 Ethovision program (Noldus, Netherlands)을 이용하여 기록 및 측정하였다.
- 모든 측정값은 평균값 ± 표준오차로 표시하였고, 실험 결과는 one way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였다. 유의성이 인정될 경우 Student-Newman-Keuls Method를 이용하여 p < 0.
- 모든 측정값은 평균값 ± 표준오차로 표시하였고, 실험 결과는 one way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였다. 유의성이 인정될 경우 Student-Newman-Keuls Method를 이용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 합환피의 물 추출물의 인지 능력 및 기억력 개선 효과를 조사하기 위하여 약물의 단독투여 또는 scopolamine으로 유도된 건망증 모델을 이용하였다. 수동회피시험(passive avoidance test)과 Morris 수중미로시험(Morris water maze test), Y-미로 시험(Y-maze test)를 수행하고 acetylcholinesterase 활성 억제 및 acetylcholine 함량을 측정하여 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 수동회피시험은 학습 및 기억력 측정을 위하여 널리 이용되고 있는 실험으로 본 실험에서는 LeDoux의 방법16)을 응용하여 시행하였다. 실험 시작 1시간 전에 실험동물을 행동관찰실로 옮기고 약물을 투여한 후 안정시켰다.
성능/효과
- Y-미로 시험(Y-maze test)에서 합환피 물추출물 (200mg/kg) 투여는 spontaneous alternation을 유의적으로 증가시켰으며, 또한 스코폴라민 투여에 의하여 감소하는 spontaneous alternation을 유의성 있게 회복시키는 것으로 볼 때 학습 기억력이 회복되었다는 것을 알 수 있었다.
- 전체적으로 합환피 물추출물은 수동회피실험, Y-미로실험, 수중미로실험에서 양성대조군인 THA와 비슷한 양상으로 기억력을 향상시켰으며, scopolamine에 의한 Ach 함량 저하를 THA 투여군보다 더 효과적으로 회복시켰다. 또한, scopolamine에 의한 기억력 손상 마우스에서 뿐만 아니라 정상 마우스에서도 인지 및 학습 능력, 기억력을 증진시키는 효과를 나타냈다. 합환피 물추출물은 AChE 활성을 억제하는 경로와 cholinergic 신경계 둘 다를 활성화시킴으로써 기억력을 향상시키는 기전을 갖는 것으로 추측된다.
- 수동회피실험(Passive avoidance test)에서는 합환피 물추출물의 단회투여로 인하여 latency time이 대조군에 비해 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 스코폴라민으로 유도한 건망증 마우스 모델을 사용한 수동회피실험에서도 latency time이 길어졌다는 것은 합환피 물추출물이 정상인의 인지기능 및 기억력 개선 증상뿐만 아니라 치매 치료 및 예방에서도 유효한 효과가 있을 것이라는 사실을 의미한다.
- 수동회피실험(Passive avoidance test)에서는 합환피 물추출물의 단회투여로 인하여 latency time이 대조군에 비해 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 스코폴라민으로 유도한 건망증 마우스 모델을 사용한 수동회피실험에서도 latency time이 길어졌다는 것은 합환피 물추출물이 정상인의 인지기능 및 기억력 개선 증상뿐만 아니라 치매 치료 및 예방에서도 유효한 효과가 있을 것이라는 사실을 의미한다.
- 또한, 합환피 물추출물만을 투여했을 때 exploration time in target quadrant이 증가하였고, 스코폴라민 투여로 인하여 감소된 시간을 다시 증가시킴으로써 학습 기억능력이 회복되는 것을 관찰하였다. 이를 통해 합환피의 물 추출물은 scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴 동물 모델에서 장기기억 개선효과를 나타내는 것으로 판단된다.
- 3A). 인지기능에 손상을 유발하는 scopolamine을 처리한 경우 escape latency가 약 100초 정도로 증가하지만, 합환피 물추출물을 200 mg/kg로 투여함으로 인하여 약 50초 정도로 감소되어 인지기능이 회복됨을 알 수 있었다(Fig. 3B).
- 전체적으로 합환피 물추출물은 수동회피실험, Y-미로실험, 수중미로실험에서 양성대조군인 THA와 비슷한 양상으로 기억력을 향상시켰으며, scopolamine에 의한 Ach 함량 저하를 THA 투여군보다 더 효과적으로 회복시켰다. 또한, scopolamine에 의한 기억력 손상 마우스에서 뿐만 아니라 정상 마우스에서도 인지 및 학습 능력, 기억력을 증진시키는 효과를 나타냈다.
- 정상 마우스에서 감금실험(retention trial) 시의 latency time이 75 ± 13.38초였으나 합환피 물추출물을 200 mg/kg 투여한 후 161 ± 22.72초로 유의적으로 증가하였다(Fig. 1A).
- 콜린성 신경계에 작용하는 아세틸콜린 함량과 이를 분해하는 효소 (AChE)의 활성을 측정한 결과, 합환피 물추출물 투여는 스코폴라민으로 유도되는 AChE의 활성을 유의적으로 저해하고 스코폴라민으로 감소되는 Ach의 함량을 회복시키는 것으로 관찰되었다. 본 연구를 통해 합환피 물추출물이 정상 상태의 마우스에서 단회경구 투여 시 기억력을 강화시킬 뿐만 아니라 scopolamine으로 유도된 건망증 모델에서도 기억력 개선효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있어, 향후 기억력 감퇴 개선 및 증진제 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 04 U/mg protein로 증가한다. 합환피 물추출물군은 0.42 ± 0.03 U/mgprotein, 양성 대조군인 THA군은 0.38 ± 0.03 U/mg protein으로 각각 scopolamine군보다 15%, 23% 정도 유의적으로 활성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 4A).
- 또한, scopolamine에 의한 기억력 손상 마우스에서 뿐만 아니라 정상 마우스에서도 인지 및 학습 능력, 기억력을 증진시키는 효과를 나타냈다. 합환피 물추출물은 AChE 활성을 억제하는 경로와 cholinergic 신경계 둘 다를 활성화시킴으로써 기억력을 향상시키는 기전을 갖는 것으로 추측된다.
후속연구
- 콜린성 신경계에 작용하는 아세틸콜린 함량과 이를 분해하는 효소 (AChE)의 활성을 측정한 결과, 합환피 물추출물 투여는 스코폴라민으로 유도되는 AChE의 활성을 유의적으로 저해하고 스코폴라민으로 감소되는 Ach의 함량을 회복시키는 것으로 관찰되었다. 본 연구를 통해 합환피 물추출물이 정상 상태의 마우스에서 단회경구 투여 시 기억력을 강화시킬 뿐만 아니라 scopolamine으로 유도된 건망증 모델에서도 기억력 개선효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있어, 향후 기억력 감퇴 개선 및 증진제 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 결과들로부터 본 연구는 합환피는 치매와 같은 기억력 감퇴와 관련된 증상을 가지고 있는 환자들뿐만 아니라 정상인들에게도 효과를 보일 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 이를 통하여 관련 질환에 대하여 부작용이 적은 예방 및 치료제로 개발할 수 있는 후보물질이라고 사료된다.
- 이를 통하여 관련 질환에 대하여 부작용이 적은 예방 및 치료제로 개발할 수 있는 후보물질이라고 사료된다. 향후, 합환피 물추출물의 인지 및 기억력 개선 작용에 대한 자세한 기전 탐색과 유효성분에 대한 연구가 진행되어야 할 필요성이 있다고 판단된다.
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