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문제 정의
- 이 연구의 목적은 국내에서 시도되지 않았던 탄저균, 콜레라균, 이질균 및 천연두바이러스의 4종 병원체를 실시간중합효소연쇄반응을 이용하여 한 번의 반응으로 4종을 모두 검출할 수 있는 방법을 제시하는 데 있다.
제안 방법
- 본 연구는 실시간중합효소연쇄반응의 방법적 특성을 활용 및 동일한 프로토콜을 적용하여 탄저균, 콜레라균, 이질균 및 천연두바이러스의 4개 병원체, 8종 유전자를 한 번의 실험을 통해 검출하였다. 비록 장비에서 한 번에 검출할 수 있는 유전자의 종류가 한정되어 있기 때문에 같은 튜브에서 검출되는 것은 아니지만 미지의 시료를 한 번에 검출할 수 있기 때문에 다른 튜브를 사용하는 것이 중요한 문제가 되지 않는다.
- 정제된 플라스미드가 아닌 실제 병원체 DNA에서 검출 민감도를 확인하기 위하여 각 병원체 DNA를 10 pg/㎕, 1 pg/㎕, 100 fg/㎕, 10 fg/㎕, 1 fg/㎕로 각각 1/10씩 희석하여 검출 민감도를 확인하였다. 시험 결과의 X축은 Ct(Cycle threshold, probe의 형광 값이 일정 수준을 넘어 기기에서 인식할 수 있을 때의 Cycle 수) 값을 의미하며, Y축은 검출 형광 값의 수치를 나타낸다.
- 타깃 유전자는 검증시스템의 양성대조물질로 활용하기 위해 유전자 합성서비스(Bioneer Corp., South Korea)를 이용하여 유전자를 합성하였으며, 플라스미드는 Escherichia coli DH5α(Real Biotech Corporation, Banqiao City, Taipei county, Taiwan)를 이용해 클로닝을 하였다. 플라스미드는 AccuPrepⓇ Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer Corp.
- 탄저균, 콜레라균, 이질균 및 천연두바이러스의 4가지 병원체를 검출을 위한 검증 시스템의 성능을 확인하기 위하여 합성된 8종의 플라스미드를 활용하여 실험을 진행하였다(Table 4). 본 실험에서는 각 유전자들을 혼합하고, 토양에서 DNA를 추출 및 혼합하였다.
대상 데이터
- , Daejeon, South Korea)를 사용하였다. 반응 혼합물은 mastermix 12.5 ㎕, primer mix 5 ㎕, 0.5X ROX dye 1 ㎕, DEPC DW 1.5 ㎕를 사용하였으며, 플라스미드 및 병원체 DNA는 5 ㎕를 사용하였다. 실시간 중합효소연쇄반응의 반응 온도는 Table 3과 같다.
- 추출된 탄저균, 콜레라균, 이질균, 천연두바이러스의 DNA는 국방과학연구소 제5기술본부로부터 제공받았다. 천연두바이러스는 병원체가 없기 때문에 본 연구에서는 천연두바이러스의 백신균주인 Vaccinia virus를 사용하였다.
- 추출된 탄저균, 콜레라균, 이질균, 천연두바이러스의 DNA는 국방과학연구소 제5기술본부로부터 제공받았다. 천연두바이러스는 병원체가 없기 때문에 본 연구에서는 천연두바이러스의 백신균주인 Vaccinia virus를 사용하였다.
- , South Korea)를 이용하여 유전자를 합성하였으며, 플라스미드는 Escherichia coli DH5α(Real Biotech Corporation, Banqiao City, Taipei county, Taiwan)를 이용해 클로닝을 하였다. 플라스미드는 AccuPrepⓇ Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer Corp., Daejeon, South Korea)를 사용하여 추출하였으며, 병원체 DNA는 ExiprepTM Bacteria Genomic DNA Kit(Bioneer Corp., Daejeon, South Korea)을 사용하여 추출하였다.
데이터처리
- 검출에 필요한 primer와 probe는 Primer 3 software version 0.4.0[17]을 사용하여 설계 하였으며, 실시간중합 효소연쇄반응은 AccuPowerⓇ Plus DualStar qPCR Master Mix(Bioneer Corp., Daejeon, South Korea)를 사용하였다. 반응 혼합물은 mastermix 12.
- 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한 실험 장비는 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하였으며, 결과 분석을 위해 분석 프로그램으로 7500 software version 2.06을 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구 결과는 100 fg/㎕, 10 fg/㎕ 같은 낮은 농도의 병원체를 검출할 수 있어 생물테러로 활용 될 수 있는 병원체를 보다 쉽게 검출할 수 있다는 장점이 있다. 또한 2001년 미국에서의 생물작용제를 이용한 미지의 생물작용제를 이용한 테러에서 생물작용제를 한 번의 실험을 통해 확인함으로써 조기 진단 및 치료에 기여할 수 있을 것이라 기대된다.
- 합성된 플라스미드를 사용하여 20 copies/㎕까지 검출이 확인됨에 따라 ㎕당 20개의 병원체가 존재하는 경우 검출이 가능함을 확인하였으며, 각 균주를 사용한 시험을 통해 100 fg/㎕까지 확인하였다. 비록 환경 유래, 감염된 환자 검체 등을 활용하여 시험하지는 않았으나, 유사한 병원체 DNA를 이용한 특이도 시험 및 토양에 존재하는 다양한 DNA를 혼합 실험함으로써 환경 유래, 감염된 환자 검체 등에서 포함되어 있는 다량의 DNA로 인해 발생할 수 있는 중합효소연쇄 반응의 저해현상을 확인하여 결과 오차를 최소화 하였다.
- 실제 병원체를 사용하여 실험한 결과 각 병원체당 최소 10 fg/㎕부터 실험에 사용한 최대 농도인 10 pg/ ㎕까지 검출됨이 확인되었다. 1/10씩 희석한 sample의 모든 농도에서 검출됨에 따라 실험에서 사용한 최대 농도 10 pg/㎕ 보다 높은 경우에도 검출될 수 있음을 의미한다.
- 특이도 실험 결과에 따라 탄저균, 콜레라균, 이질균 및 천연두바이러스의 4종을 제외한 20종 병원체에서 나타나지 않았기 때문에 검증 시스템은 특이적으로 4종의 병원체만을 검출할 수 있다. 한편 탄저균인 Bacillus anthracis와 Bacillus cereus는 유전학적으로 같은 목에 속하기 때문에 chromosome에 위치한 Ba813은 Bacillus anthracis와 Bacillus cereus 두 종 모두 나타난다.
- 비록 장비에서 한 번에 검출할 수 있는 유전자의 종류가 한정되어 있기 때문에 같은 튜브에서 검출되는 것은 아니지만 미지의 시료를 한 번에 검출할 수 있기 때문에 다른 튜브를 사용하는 것이 중요한 문제가 되지 않는다. 합성된 플라스미드를 사용하여 20 copies/㎕까지 검출이 확인됨에 따라 ㎕당 20개의 병원체가 존재하는 경우 검출이 가능함을 확인하였으며, 각 균주를 사용한 시험을 통해 100 fg/㎕까지 확인하였다. 비록 환경 유래, 감염된 환자 검체 등을 활용하여 시험하지는 않았으나, 유사한 병원체 DNA를 이용한 특이도 시험 및 토양에 존재하는 다양한 DNA를 혼합 실험함으로써 환경 유래, 감염된 환자 검체 등에서 포함되어 있는 다량의 DNA로 인해 발생할 수 있는 중합효소연쇄 반응의 저해현상을 확인하여 결과 오차를 최소화 하였다.
후속연구
- 본 연구 결과는 100 fg/㎕, 10 fg/㎕ 같은 낮은 농도의 병원체를 검출할 수 있어 생물테러로 활용 될 수 있는 병원체를 보다 쉽게 검출할 수 있다는 장점이 있다. 또한 2001년 미국에서의 생물작용제를 이용한 미지의 생물작용제를 이용한 테러에서 생물작용제를 한 번의 실험을 통해 확인함으로써 조기 진단 및 치료에 기여할 수 있을 것이라 기대된다.
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