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문제 정의
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 항암 효과를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. [Fig.
- 따라서 본 연구에서는 Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 융복합적인 항염증 및 항암 효과를 연구함으로써 홍삼 내 기능성분을 보다 유효하고 적절하게 사용할 수 있도록 하기 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
- 인위적인 가열보다 균주를 활용하여 홍삼에 들어있는 성분 중 함량이 작은 사포닌의 함량이 증가하는지를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 인삼 무발효물과 균주 발효물의 사포닌 함량의 차이가 성분별로 거의 유의미하게(p<0.
제안 방법
- B16F10 세포주를 6웰 배양 플레이트에 각 웰당 4만개의 세포를 부착시킨 후 24시간 후에 물질 compoundk, Rh2, mixture(compound k, Rh2)를 50마이크로몰로 처리하였다. 6시간 후 PBS 세척을 하고 propidium iodide(sigma. Korea)와 FITC conjugated annexin V(sigma. Korea)를 염색하여 FACS 분석을 수행하였다.
- Apoptosis와 관련된 분자의 발현 양상을 확인하기 위해 FACS (FACSVerse, BD Korea)를 사용하여 측정 하였다. B16F10 세포주를 6웰 배양 플레이트에 각 웰당 4만개의 세포를 부착시킨 후 24시간 후에 물질 compoundk, Rh2, mixture(compound k, Rh2)를 50마이크로몰로 처리하였다.
- Apoptosis와 관련된 분자의 발현 양상을 확인하기 위해 FACS (FACSVerse, BD Korea)를 사용하여 측정 하였다. B16F10 세포주를 6웰 배양 플레이트에 각 웰당 4만개의 세포를 부착시킨 후 24시간 후에 물질 compoundk, Rh2, mixture(compound k, Rh2)를 50마이크로몰로 처리하였다. 6시간 후 PBS 세척을 하고 propidium iodide(sigma.
- B16F10과 Hacat 세포를 96웰 배양 플레이트에 한 웰당 1만개로 분주하여 24시간 후 compound K, Rh2, 두 가지 물질이 혼합된 mixture를 B16F10은 10, 25, 50, 100, 250, 500uM로 처리하고, Hacat은 1, 2.5, 5, 10, 25, 50uM로 처리한 후 48시간 배양하였다. 세포의 생존 여부를 확인하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척한 후 배양액 100ul씩 주입 후 cell counting kit-8(dojindo, Japan)을 이용하여 한 웰당 10ul씩 주입 후 4시간 반응을 시켰다.
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물 처리를 한 세포에서는 좀 더 세포의 탈착이 가중되는 현상을 관찰하였다[Fig. 12].
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 독성이 없는 농도인 25 μM와 10 μM의 농도에서 항암효과에 대한 실험을 진행하였다.
- pStat3-Luc가 발현된 Hep3B 세포는 96-well 플레이트에 2x104 cells/well을 넣고 24시간 동안 배양한 후, 12시간동안 DMEM (GIBCO 119950965)배지로 무혈청 배양 (serum starvation)을 실시하였다. 이 세포에 10 ng/mL IL-6 (R&D system, USA)와 화합물을 첨가하여 12시간 동안 배양한 후, 반응한 세포를 PBS로 세척하고 50 μL 용해 완충용액 (luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20분간 교반한 후, 30-100 μL의 루시퍼라제 기질 (luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색정도를 루미노미터 (luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였다.
- 그 결과 세포사멸(apoptosis)이 이루어질 때 발현되어지는 annexin V가 전혀 발현되지 않아 세포사멸이 apoptosis의 메카니즘에 관련된 세포사의 신호 전달 체계와는 또다른 세포사멸 메카니즘으로 사멸되어진다는 것을 예측할 수 있었다. propidium iodide 염색을 통해 세포사멸을 통한 세포가 죽는 현상은 관찰하였다. 그 결과 세포막의 변화나 chromosome condensation, apoptotic body 등의 반응이 관찰 되지 않았기 때문에 세포사멸의 원인이 전형적인 apoptosis의 메카니즘이 아닌 다른 형태의 세포사멸 메카니즘과 연결이 있을 것으로 판단되어진다[Fig.
- 세포의 생존 여부를 확인하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척한 후 배양액 100ul씩 주입 후 cell counting kit-8(dojindo, Japan)을 이용하여 한 웰당 10ul씩 주입 후 4시간 반응을 시켰다. 반응 후 발색된 formagan을 확인하고 Gemini(Molecular device, microplate reader)를 통해 450nm 파장에서 값을 읽어 세포의 생존 농도를 측정하였다. 현미경(optinity.
- 세포사멸에 따르는 신호의 기전에 대한 제시를 하기 위해 annexin V에 FITC가 레이블 되어 있는 항체와 propidium iodide염색를 사용하여 확인하였다. 그 결과 세포사멸(apoptosis)이 이루어질 때 발현되어지는 annexin V가 전혀 발현되지 않아 세포사멸이 apoptosis의 메카니즘에 관련된 세포사의 신호 전달 체계와는 또다른 세포사멸 메카니즘으로 사멸되어진다는 것을 예측할 수 있었다.
- 5, 5, 10, 25, 50uM로 처리한 후 48시간 배양하였다. 세포의 생존 여부를 확인하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척한 후 배양액 100ul씩 주입 후 cell counting kit-8(dojindo, Japan)을 이용하여 한 웰당 10ul씩 주입 후 4시간 반응을 시켰다. 반응 후 발색된 formagan을 확인하고 Gemini(Molecular device, microplate reader)를 통해 450nm 파장에서 값을 읽어 세포의 생존 농도를 측정하였다.
- 이 세포에 10 ng/mL IL-6 (R&D system, USA)와 화합물을 첨가하여 12시간 동안 배양한 후, 반응한 세포를 PBS로 세척하고 50 μL 용해 완충용액 (luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20분간 교반한 후, 30-100 μL의 루시퍼라제 기질 (luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색정도를 루미노미터 (luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였다.
- 표피세포의 경우에도 세포 간 접촉 부위가 급격히 분리되면서 표면에서 탈착되어지는것을관찰하였다[Fig. 15].
- 반응 후 발색된 formagan을 확인하고 Gemini(Molecular device, microplate reader)를 통해 450nm 파장에서 값을 읽어 세포의 생존 농도를 측정하였다. 현미경(optinity. Korea)를 통해 각 농도별 세포 외형의 변화를 관찰하고 촬영을 하였다.
- 홍삼의 추출 조건에 따른 사포닌의 함량 및 분포도를 확인하기 위해 홍삼을 70%에탄올(생약의 8배수)로 시간을 달리하여 autoclave를 실행하여 사포닌의 생성 및 함량의 변화를 비교하였다. 전반적으로 사포닌 함량은 시간에 따라 Rg3나 Rh2는 유의미한 차이(p<0.
대상 데이터
- CAPCELLPAK C18 UG120 (SHISEIDO) 컬럼을 사용하였고 컬럼 오븐 온도는 28℃, UV디텍터 203nm, 용매로 CH3CN을 사용하였다. injection volume은 25uL, flow rate는 1ml/min으로 설정하였다.
- 무발효 대조군으로, 인삼 100 g당 8배량(w/v)의 DW로 3회 추출한 후 여과하여 동결 건조하여 얻어진 물추출물(이하 무발효 추출물)을 사용하였다.
- 발효에 사용된 균주는 Lactobacillus plantarum KCTC 3104(LP), Bacillus subtilis KCTC 1022(BS), Candida utilis KCCM 50342(CU), Lactobacillus casei KCTC 2180(LC), 으로 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea) 에서 분양받아 사용하였다. LP 및 LC는 Lactobacilli MRS broth, BS는 Nutrient broth, CU, SC는 YM broth로 배양하였다.
- Germany)을 사용하였다. 배양 조건은 B16F10의 경우 MEM(Gibco. Korea)에 10% FBS(Gibco. Korea)와 peniciline-streptomycine(Gibco. Korea) 10000u을 혼합하여 5% 이산화탄소, 37도에서 배양하였다. Hacat의 경우 DMEM(Gibco.
- 세포실험을 위해 마우스 유래의 피부암 세포주인 B16F10(ATCC. USA)와 인간 유래의 keratinocyte인 Hacat (CLS. Germany)을 사용하였다. 배양 조건은 B16F10의 경우 MEM(Gibco.
- 인삼은 시중에서 구매하여 실험하였다.
데이터처리
- 성분 함량 분석과 항암효과 실험결과는 SPSS 21 통계패키지를 이용하여 각각 Independent Samples T-test, one-way ANOVA로 통계처리하였고, p<0.05 이하 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 IL-6 감소율을 측정한 결과, Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물에서 농도 의존적으로 IL-6 감소를 나타내었으며, 그 중 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 102%의 IL-6 감소율을 관찰할 수 있었다[Fig. 5].
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 대량 생산된 추출물의 Hep3B 세포에서의 독성을 측정한 결과 10 ㎍/㎖ 농도에서는 98% 이상의 세포생존율을 나타내어 세포독성이 없는 반면, 30 ㎍/㎖ 농도에서는 55 % 이하의 세포생존율을 나타냈음을 확인하였다[Fig. 4].
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 일원분산분석을 실시한 결과 [Table 4]와 같이 그룹별로 유의미한 차이가 나타났다.
- Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물의 항암 효과를 규명하기 위하여 일원분산분석을 실시한 결과 그룹별로 유의미한 차이가 있었다[Table 3].
- [Fig. 6]에서 보는 바와 같이 melamoma 흑색종 세포에 증폭시킨 추출물을 처리한 결과 50 μM에서 추출물 자체의 독성으로 인해 세포가 사멸하는 것을 관찰하였다.
- [Fig. 7]과 [Fig. 8]에서 관찰되어지는 바와 같이 각각 ginsenoside Rh2, CK을 단일 물질로 처리했을 때 저 농도에서 세포질의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있는데, 그 양상이 상이하게 다른 것을 확인 할 수 있었다. ginsenoside Rh2는 세포의 모양이 길고 가늘게 감소하는 경향을 보이는 반면 CK는 핵을 중심으로 수축되는 양상이 관찰되었다.
- keratinocyte에 ginsenoside Rh2, CK 단일 물질을 처리 후 세포들의 외형을 관찰하면 50 μM에서 세포가 사멸되는 현상을 확인 할 수 있으며 바닥에서 떨어지면서 세포들이 사멸되는 것을 확인할 수 있었다[Fig. 10, Fig. 11].
- 구체적으로 보면 홍삼을 70% 에탄올로 30분 동안 autoclave한 것보다 120분 동안 autoclave 하였을 때 사포닌 중 홍삼을 발효하거나 흑삼을 만들었을 때 생성이 되어지는 ginsenoside Rg3나 Rh2, CK와 같은 특정 ginsenoside가 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 홍삼 사포닌의 경우 다른 화합물 보다는 열에 비교적 안정하지만 오랜 시간 가열을 하면 사포닌에 붙어있는 당들이 떨어져 또 다른 새로운 이성질체가 많이 생성되는 것을 확인할 수 있었다[Fig. 2].
- 세포사멸에 따르는 신호의 기전에 대한 제시를 하기 위해 annexin V에 FITC가 레이블 되어 있는 항체와 propidium iodide염색를 사용하여 확인하였다. 그 결과 세포사멸(apoptosis)이 이루어질 때 발현되어지는 annexin V가 전혀 발현되지 않아 세포사멸이 apoptosis의 메카니즘에 관련된 세포사의 신호 전달 체계와는 또다른 세포사멸 메카니즘으로 사멸되어진다는 것을 예측할 수 있었다. propidium iodide 염색을 통해 세포사멸을 통한 세포가 죽는 현상은 관찰하였다.
- ginsenoside Rh2는 세포의 모양이 길고 가늘게 감소하는 경향을 보이는 반면 CK는 핵을 중심으로 수축되는 양상이 관찰되었다. 두 종류의 추출물을 고농도로 처리 시 세포막의 부착 능력이 떨어져 바닥에서 이탈되면서 사멸되는 현상이 유사하게 나타나는 것을 관찰할 수 있다. Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 홍삼 분획물 처리군의 경우 세포 외형의 변화가 25 μM부터 관찰되었으며, 50 μM에서 죽는 세포들이 관찰되었다[Fig.
- 유사한 현상이 유발되는지 확인하기 위해 다른 암세포인 MCF세포( breast cancer cell line)에 추출물을 처리한 결과 흑색종과 표피세포와 유사하게 떨어지면서 세포가 사멸되는 현상을 관찰할 수 있었다[Fig. 16].
- 이러한 결과를 토대로 세포 사멸 메카니즘이 apoptosis가 아닌 anoikis 메카니즘에 의한 세포사멸일 수 있다는 가정을 할 수 있다. 이런 메카니즘을 규명하기 위해서는 세포막에 있는 세포부착 단백질의 변화를 연구하면 좀 더 명확한 세포사멸의 메카니즘을 규명할 수 있을거라 예상되어진다.
- 흑색종 세포에 추출물 50 μM로 처리 후 관찰한 결과 세포질의 분포가 약해지며 세포가 원형으로 변하면서 표면에서 떨어지는 현상이 관찰되었다[Fig. 14].
후속연구
- 이런 결과들을 통하여 흑색종의 종양 세포주를 활용하여 암세포를 억제 할 수 있는 실험과 표피세포의 세포 실험을 통해 세포에 대한 독성 농도의 측정을 함으로써 Ginsenoside Rh2와 CK가 증폭된 추출물을 다른 효능이 있는 물질과 혼합하여 효능을 입증하는 자료를 얻을 때 사멸되는 농도에 대한 가이드라인에 기여할 수 있을 것이라 사려 된다.
- 이러한 결과를 토대로 세포 사멸 메카니즘이 apoptosis가 아닌 anoikis 메카니즘에 의한 세포사멸일 수 있다는 가정을 할 수 있다. 이런 메카니즘을 규명하기 위해서는 세포막에 있는 세포부착 단백질의 변화를 연구하면 좀 더 명확한 세포사멸의 메카니즘을 규명할 수 있을거라 예상되어진다.
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