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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 자실체 생김새가 다른 원형영지버섯 및 녹각영지버섯의 일반성분, 아미노산, 지방산, 무기질, β-glucan 및 수용성 비타민 함량을 조사하였다.
가설 설정
- 1)All values are presented as the mean±SD of triplicate determination.
- 3)ND, not detected.
제안 방법
- 2.45 mM K2S2O8 5 mL와 7 mM ABTS⦁+ 5 mL를 혼합한 후 암실에서 12-16시간 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성시킨 후 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS 용액 0.9 mL와 농도별 추출물 0.1 mL를 첨가하여 3분간 정치 시켜 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- , Petaluma, CA, USA)를 사용하여 유효성분 물질(phenolics 및 flavonoid), 항산화 및 효소 저해활성을 측정하였다. Gas chromatography(GC)는 Agilent GC 7890 series(Agilent Co., Forest Hill, Australia)를 사용하여 지방산을 분석하였다. High pressure liquid chromatography(HPLC)는 Agilent HPLC 1200 series(Agilent Co.
- , Forest Hill, Australia)를 사용하여 지방산을 분석하였다. High pressure liquid chromatography(HPLC)는 Agilent HPLC 1200 series(Agilent Co.,)를 사용하여 수용성 비타민 함량을 분석하였다. 한편 무기질 함량 분석은 inductively coupled plasma spectrometer(ICP)와 iCAP6300 Duo ICP spectrometer(Thermo Scientific, London, UK)를 사용하였고 아미노산 함량 분석은 자동 아미노산 분석기(L-8900, Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
- Phenolics 함량은 Folin-Denis법(16)을 약간 변형하여 측정하였다. 추출물 0.
- 01 mL를 가하여 37℃ 항온수조에서 1시간 방치시켰다. 그 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였고, rutin을 이용하여 작성한 표준 검량곡선으로부터 값을 산출하였다.
- 5 g에 70% 질산 용액 8 mL를 첨가하여 microwave로 분해하였다. 그 후 50 mL의 멸균증류수로 정용하여 시험용액을 조제한 후 ICP(inductively coupled plasma)로 분석하였다. 한편 나트륨은 550-600℃ 회화로에서 회화한 후 30 mL의 3% 질산 용액으로 정용하여 ICP로 분석하였다.
- 농축된 시료는 soduim citrate buffer(pH 2.2) 2 mL를 첨가하여 용해 후 0.45 μm membrane filter(Dismic-25CS, Toyoroshikaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 자동 아미노산 분석기를 사용하여 분석하였다.
- , Tokyo, Japan)를 이용하여 60℃에서 농축하여 추출물을 얻었다. 농축된 시료는 추출용매로 녹여 각각 1.0, 0.5 및 0.25 mg/mL 농도로 제조하여 항산화 활성 및 효소저해활성을 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 자실체 생김새가 다른 원형영지버섯 및 녹각영지버섯의 일반성분, 아미노산, 지방산, 무기질, β-glucan 및 수용성 비타민 함량을 조사하였다. 또한 에탄올 추출조건(에탄올 농도와 추출온도)에 따른 총 phenolics 및 flavonoids 함량, 라디칼 활성 및 탄수화물과 지방 분해효소의 저해능을 평가하였다.
- 반응이 끝난 후 이소옥탄 1 mL를 첨가하고 격렬히 흔든 후 원심분리 및 이소옥탄층만을 회수하여 무수황산나트륨과 함께 탈수한 뒤 0.45 μm-membrane filter(Dismic-25CS)로 여과하여 GC를 이용하여 분석하였다.
- 25 mL 첨가 및 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 발색시켰다. 발색된 시료는 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 이용하여 작성한 표준 검량곡선으로부터 값을 산출하였다.
- 분광광도계는 Spectronic 2D(Spectronic 2D, Thermo Co., Petaluma, CA, USA)를 사용하여 유효성분 물질(phenolics 및 flavonoid), 항산화 및 효소 저해활성을 측정하였다. Gas chromatography(GC)는 Agilent GC 7890 series(Agilent Co.
- 에탄올 추출물 제조는 각각의 영지버섯 분말 10 g에 30% 50%, 70% 및 95% 에탄올을 200 mL씩 가하여 40℃ 및 70℃에서 4시간 동안 600 rpm 속도를 유지하여 추출하였다. 동일한 조건으로 2회 반복 추출하여 모은 후 여과지(No.
- DPPH 라디칼 소거능은 Hwang 등(18)의 방법에 따라 측정하였다. 즉 DPPH 용액 0.8 mL와 농도별 추출물(0.25, 0.5, 및 1.0 mg/mL) 0.2 mL를 가해 암실에서 30분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 그 후 50 mL의 멸균증류수로 정용하여 시험용액을 조제한 후 ICP(inductively coupled plasma)로 분석하였다. 한편 나트륨은 550-600℃ 회화로에서 회화한 후 30 mL의 3% 질산 용액으로 정용하여 ICP로 분석하였다.
- ,)를 사용하여 수용성 비타민 함량을 분석하였다. 한편 무기질 함량 분석은 inductively coupled plasma spectrometer(ICP)와 iCAP6300 Duo ICP spectrometer(Thermo Scientific, London, UK)를 사용하였고 아미노산 함량 분석은 자동 아미노산 분석기(L-8900, Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
대상 데이터
- α-Glucosidase, α-amylase 및 pancreatic lipase 역시 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였고 Megazyme Kit(Mushroom and Yeast β-glucan Assay Procedure K-YBGL)은 Megazyme International Ireland(Bray, Wicklow, Ireland)에서 구입하였다.
- α-Glucosidase, α-amylase 및 pancreatic lipase 역시 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였고 Megazyme Kit(Mushroom and Yeast β-glucan Assay Procedure K-YBGL)은 Megazyme International Ireland(Bray, Wicklow, Ireland)에서 구입하였다. HPLC- grade H2O, methanol, acetonitrile 및 glacial acetic acid는 Fisher Scientific(Fairlawn, NJ, USA)에서 구입하였다. 이 외에 분석을 위한 시약은 필요에 따라 특급 혹은 1급을 구입하여 사용하였다.
- )를 사용하였다. 검출 파장은 450 nm(비타민 B1), 530 nm(비타민 B2)및 260 nm(비타민 B3)에서 정량하였다.
- 본 실험에 사용한 원형 및 녹각영지버섯(Genoderma Lucidum)은 전라북도 임실영지버섯영농조합법인으로부터 제공받았으며 경상남도 농업기술원 버섯과로부터 검증 받은 후 사용하였다. 수용성 비타민(thaimine, riboflavin 및 niacin), Folin-Cialteu phenol, diethylene glycol, 2-deoxyribose, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt(ABTS) p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(p-NPG) 및 p-nitrophenylbutyrate(p-NPB)는 Sigma-Aldrich(St.
- 분석 칼럼은 capcell-pak C18(4.6×150 mm, 5 μm) 및 capcell-pak C18 MG(4.6×250 mm, 5 μm)을 사용하였고 이동상 용매 A는 비타민 B1의 경우 10 mM NaH2PO4/0.15 M NaClO4 in H2O, 비타민 B2는 10mM NaH2PO4 in H2O(pH 5.5) 및 비타민 B3는 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% acetic acid in H2O를 사용하였고, 이동상 B는 비타민 B1과 B2는 메탄올, 비타민 B3는 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% acetic acid in H2O:메탄올(35:65)을 사용하였다.
- 수용성 비타민(thaimine, riboflavin 및 niacin), Folin-Cialteu phenol, diethylene glycol, 2-deoxyribose, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt(ABTS) p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(p-NPG) 및 p-nitrophenylbutyrate(p-NPB)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 8% trichloroaceric acid를 각각 1 mL를 가하여 100℃에서 20분간 가열하여 발색 및 냉각시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 PBS 완충액(NaCl 8.76 g, NaH2PO4 0.11 g, Na2HPO4 0.596 g)을 사용하였고 라디칼 소거능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다(19).
데이터처리
- 2)All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- All values within a column with different superscript letters of different extraction systems (EtOH concretions and temperatures) with significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 실험 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산분석을 수행하였고 평균 ±표준편차로 나타내었다.
- 한편 각각의 분석 결과에 대환 유의성 검정은 분산분석 후 p<0.05 수준에서 Ducan’s multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거능은 Hwang 등(18)의 방법에 따라 측정하였다. 즉 DPPH 용액 0.
- Flavonoids 함량은 Jia 등(17)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물 0.
- 무기질 함량은 식품공전의 무기질 분석법(14)에 준하여 수행하였다. 즉 영지버섯 분말 0.
- 비타민은 식품공전의 비타민 분석법(14)에 준하여 시료 전처리 후 HPLC로 분석하였다. 분석 칼럼은 capcell-pak C18(4.
- 영지버섯의 β-glucan 함량 또한 식품공전법(14)에 따라 Megazyme Kit를 이용하여 분석하였다.
- 영지버섯의 일반성분은 식품공전의 일반성분 분석법(14)에 준하여 실시하였다. 즉, 수분 및 회분 함량은 상압가열건조법과 건열회화법으로 측정하였으며 조지방 및 조단백 함량은 Soxhelt과 Kjeldahl법으로 측정하였다.
- 영지버섯의 일반성분은 식품공전의 일반성분 분석법(14)에 준하여 실시하였다. 즉, 수분 및 회분 함량은 상압가열건조법과 건열회화법으로 측정하였으며 조지방 및 조단백 함량은 Soxhelt과 Kjeldahl법으로 측정하였다. 탄수화물 함량 계산은 100에서 상기 각 성분의 합을 뺀 값으로 표시하였다.
- 지방산 분석은 Shin 등(15)의 방법에 준하여 수행하였다. 지방산 전처리는 각각의 버섯 분말 1 g에 0.
성능/효과
- ABTS 라디칼 소거능은 DPPH와는 다르게 추출물의 처리 농도에 따른 차이를 보이지 않았다. Fig. 2A에 나타낸 바와 같이 40℃에서 70% 에탄올로 추출한 경우 원형 영지버섯 추출물(0.25 mg/mL)은 99.51%를 나타내었고 70℃에서 70% 에탄올 추출물(0.25 mg/mL)에서는 97.26%의 아주 우수한 라디칼 소거능을 나타내었다. 40℃에서 70% 에탄올로 추출한 녹각 영지버섯(0.
- Flavonoids 함량은 총 phenolics 함량과는 달리 원형 영지버섯과 녹각 영지버섯 모두 유사한 함량을 보였다. 원형 및 녹각영지버섯의 40℃-70% 에탄올 추출물에서 각각 0.
- Hydroxyl 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼 소거능과 동일하게 추출물의 농도가 증가할수록 소거능 역시 증가하였다. 원형 영지버섯은 추출온도에 따라 거의 차이가 없었으며, 녹각 영지버섯은 40℃가 70℃보다는 약간 높은 소거능을 보였다.
- 원형 및 녹각 영지버섯의 에탄올 추출조건별 phenolics 및 flavonoids 함량은 결과적으로 40℃에서 추출하였을 시 70℃에서보다 phenolics 및 flavonoids 함량이 약간 높았으나 큰 차이는 없었으며 70% 에탄올 추출조건에서 높은 함량을 나타내었다(Table 6). Phenolics 함량은 원형 영지버섯이 녹각 영지버섯보다 월등히 높은 함량을 나타내었다. 원형 영지버섯의 경우 40℃-70% 에탄올 추출물이 10.
- 녹각 영지버섯 추출물(1.0 mg/mL) 역시 α-glucosidase 저해활성과 동일하게 40℃에서 95% 에탄올로 추출한 경우 73.07%로 가장 우수한 저해활성을 나타내었고 40℃에서 70% 에탄올로 추출한 경우에는 62.02%의 비교적 우수한 α-amylase 저해활성을 나타내었다(Fig. 5B).
- 따라서 본 연구에서는 β-glucan뿐만 아니라 phenolics 및 flaovonoids에 의한 것으로 추정되었다.
- 1-3과 같았다. 모든 라디칼 소거능은 40℃에서 추출한 경우 70℃보다 높았으나 커다란 차이를 보이지는 않았고, 원형 영지버섯이 녹각 영지버섯보다는 라디칼 소거능이 우수하였다.
- 본 연구에서는 버섯에 존재하는 β-glucan과 같은 생리활성물질의 영향으로 추출물 상태에서도 상당히 우수한 저해활성을 나타낸 것으로 추정된다.
- 이 중 철은 활성산소 제거에 관여를 하고(23), 인의 경우 세포 노화 억제에 큰 영향을 미친다고 보고되어 있다(24). 본 연구에서도 녹각 영지버섯의 인 함량이 170.90 mg/100 g으로 가장 높았고 원형 영지버섯도 비교적 높은 함유량을 나타내 이들의 잠재적 기능성이 있을 것이라 판단된다. 따라서 인체에 필요한 각종 무기질을 함유한 영지버섯은 무기질 급원에 우수한 식품으로 사료된다.
- 원형 및 녹각 영지버섯의 아미노산을 분석한 결과는 Table 2에 나타낸바와 같이 비필수 아미노산(aspartic acid, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, 및 arginine) 7 종과 필수 아미노산(threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine, 및 histidine) 7 종이 검출되어 총 14종류의 아미노산이 검출되었다. 아미노산 총 함량은 원형 영지버섯이 43.
- 원형 및 녹각 영지버섯의 에탄올 추출조건별 phenolics 및 flavonoids 함량은 결과적으로 40℃에서 추출하였을 시 70℃에서보다 phenolics 및 flavonoids 함량이 약간 높았으나 큰 차이는 없었으며 70% 에탄올 추출조건에서 높은 함량을 나타내었다(Table 6). Phenolics 함량은 원형 영지버섯이 녹각 영지버섯보다 월등히 높은 함량을 나타내었다.
- Hydroxyl 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼 소거능과 동일하게 추출물의 농도가 증가할수록 소거능 역시 증가하였다. 원형 영지버섯은 추출온도에 따라 거의 차이가 없었으며, 녹각 영지버섯은 40℃가 70℃보다는 약간 높은 소거능을 보였다. 40℃에서 70% 에탄올로 추출한 원형 영지버섯 추출물(1.
- 지방산은 포화지방산에 속하는 myristic acid(C14:0), plamitic acid(C16:0), behenic acid(C22:0), tricosylic acid(C23:0) 및 lignoceric acid(C24:0) 5 종과 불포화지방산에 속하는 cis-vaccenic acid(C18:1n7), oleic acid(C18:1n9), lineolic acid(C18:2n6) 및 α-linolenic acid(C18:3n3)는 4종이 검출되었고 지방산의 분포도 비율은 두 버섯 모두 유사하였다. 원형 영지버섯의 주요 지방산은 불포화지방산인 linoleic acid(47.56%)와 oleic acid(32.91%)로 나타났고 녹각 영지버섯은 linoleic acid가 75.68%로 지방산의 대부분을 차지하였으며 원형 및 녹각영지버섯 모두 불포화지방산이 약 80% 이상을 차지하였다.
- 한편 녹각 영지버섯 추출물(0.5 mg/mL)은 40℃에서 95% 에탄올로 추출하였을 시 α-glucosidase 저해활성이 가장 우수하였고 70% 에탄올 추출물에서는 82.83%를 나타내었다(Fig. 4B).
- 6A). 한편 녹각 영지버섯 추출물의 경우 에탄올 농도가 증가할수록 저해활성이 증가하여 95% 추출 조건에서 저해활성이 가장 우수하였고 1 mg/mL 농도에서는 40℃에서 70% 에탄올로 추출한 경우 73.07%를, 70℃에서 70% 에탄올로 추출한 경우 62.04%를 나타내었다(Fig. 6B).
후속연구
- 그러나 여러 종류의 버섯들에 대한 in vitro 및 in vivo상의 항당뇨 또는 항비만 효능은 현재 국내의 경우 많이 보고되어있으나 영지버섯에 관한 연구는 매우 부족한 것으로 조사되었다. 그러므로 향후 비만 혹은 당뇨 동물모델을 이용한 영지버섯 추출물의 in vitro와 in vivo상의 항비만과 항당뇨 효과 등의 추가적인 검증이 필요할 것으로 판단된다.
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