본 연구에서는 미생물 검출용 바이오센서 제작을 위해 재조합 람다 파아지 꼬리 단백질 J을 센싱 요소로 활용가능한지를 조사하였다. 융합 단백질의 입체 장애를 최소화하기 위해 J 단백질 절편의 N-말단을 6X His-tag로 융합하고 HisTALONTM 컬럼으로 정제하였다. 정제 단백질은 약 38 kDa 크기를 SDS-PAGE에서 나타내며 anti-His 단클론 항체와 반응하였다. Anti-His 단클론 항체는 6HN-J를 처리한 E. coli K-12와 특이적으로 결합하나 BSA 처리하거나 6HN-J 처리한 다른 미생물들(Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa)과는 결합되지 않음을 보여주었다. 또한 정제 단백질과 숙주세포의 결합은 온전한 람다 파아지의 in vivo 숙주 표면 흡착을 약 $1{\mu}g/ml$ 단백질 농도에서 50%, $25{\mu}g/ml$ 단백질 농도에서 거의 완전히 방해하였다. 결론적으로 재조합 6HN-J 단백질은 탁월한 선택성과 선별성으로 인해 바이오센서의 제작에서 센싱 요소로 활용 가능함을 시사한다.
본 연구에서는 미생물 검출용 바이오센서 제작을 위해 재조합 람다 파아지 꼬리 단백질 J을 센싱 요소로 활용가능한지를 조사하였다. 융합 단백질의 입체 장애를 최소화하기 위해 J 단백질 절편의 N-말단을 6X His-tag로 융합하고 HisTALONTM 컬럼으로 정제하였다. 정제 단백질은 약 38 kDa 크기를 SDS-PAGE에서 나타내며 anti-His 단클론 항체와 반응하였다. Anti-His 단클론 항체는 6HN-J를 처리한 E. coli K-12와 특이적으로 결합하나 BSA 처리하거나 6HN-J 처리한 다른 미생물들(Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa)과는 결합되지 않음을 보여주었다. 또한 정제 단백질과 숙주세포의 결합은 온전한 람다 파아지의 in vivo 숙주 표면 흡착을 약 $1{\mu}g/ml$ 단백질 농도에서 50%, $25{\mu}g/ml$ 단백질 농도에서 거의 완전히 방해하였다. 결론적으로 재조합 6HN-J 단백질은 탁월한 선택성과 선별성으로 인해 바이오센서의 제작에서 센싱 요소로 활용 가능함을 시사한다.
Detection of pathogenic microorganisms takes several days by conventional methods. It is necessary to assess microorganisms in a timely manner to reduce the risk of spreading infection. For this purpose, bacteriophages are chosen for use as a biosensing tool due to their host specificity, wide abund...
Detection of pathogenic microorganisms takes several days by conventional methods. It is necessary to assess microorganisms in a timely manner to reduce the risk of spreading infection. For this purpose, bacteriophages are chosen for use as a biosensing tool due to their host specificity, wide abundance, and safety. However, their lytic cycle limits their efficacy as biosensors. Phage proteins involved in binding to bacteria could be a robust alternative in resolving this drawback. Here, a fragment of tail protein J (residues 784 to 1,132) of phage lambda fused with 6X His-tag (6HN-J) at its N-terminus was cloned, overexpressed, purified, and characterized for its binding with microorganisms. The purified protein demonstrated a size of about 38 kDa in sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and bound with anti-His monoclonal antibodies. It bound specifically to Escherichia coli K-12, and not Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, or Pseudomonas aeruginosa in dot blotting. Binding of the protein to E. coli K-12 inhibited about 50% of the in vivo adsorption of the phage lambda to host cells at a concentration of $1{\mu}g/ml$ 6HN-J protein and almost 100% at $25{\mu}g/ml$ 6HN-J. The results suggest that a fusion viral protein could be utilized as a biosensing element (e.g., protein chips) for detecting microorganisms in real time.
Detection of pathogenic microorganisms takes several days by conventional methods. It is necessary to assess microorganisms in a timely manner to reduce the risk of spreading infection. For this purpose, bacteriophages are chosen for use as a biosensing tool due to their host specificity, wide abundance, and safety. However, their lytic cycle limits their efficacy as biosensors. Phage proteins involved in binding to bacteria could be a robust alternative in resolving this drawback. Here, a fragment of tail protein J (residues 784 to 1,132) of phage lambda fused with 6X His-tag (6HN-J) at its N-terminus was cloned, overexpressed, purified, and characterized for its binding with microorganisms. The purified protein demonstrated a size of about 38 kDa in sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and bound with anti-His monoclonal antibodies. It bound specifically to Escherichia coli K-12, and not Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, or Pseudomonas aeruginosa in dot blotting. Binding of the protein to E. coli K-12 inhibited about 50% of the in vivo adsorption of the phage lambda to host cells at a concentration of $1{\mu}g/ml$ 6HN-J protein and almost 100% at $25{\mu}g/ml$ 6HN-J. The results suggest that a fusion viral protein could be utilized as a biosensing element (e.g., protein chips) for detecting microorganisms in real time.
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문제 정의
본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해 J 단백질 C 절편(784~1,132잔기)의 N-말단에 6개의 히스티딘 표지를 붙인 유전자를 클로닝하고 단백질을 발현하고 정제하여 미생물과의 결합여부를 조사하였다. 정제 단백질과 E.
파아지는 센싱 요소로서 높은 특이성의 장점과 숙주 세포 융해의 단점을 가지고 있다[24]. 본 연구에서는 이를 해소하기 위해 온전한 파아지 대신 결합에 관여하는 람다 파아지 꼬리 단백질 J의 일부분을 클로닝하여 바이오센서의 제작(예, 단백질 칩)에서 센싱 요소로 활용 가능한지를 조사하였다(Fig. 1). 람다 파아지 꼬리 유전자 J (잔기 784~1,132)를 주문 제작한 프라이머로 증폭하였다.
본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해 J 단백질 C 절편(784~1,132잔기)의 N-말단에 6개의 히스티딘 표지를 붙인 유전자를 클로닝하고 단백질을 발현하고 정제하여 미생물과의 결합여부를 조사하였다. 정제 단백질과 E. coli K-12와의 결합이 in vivo 파아지 흡착에 미치는 영향도 조사하였다. 본 연구 결과는 미생물검출에서 파아지 융합 단백질이 신속하고 신뢰할 수 있는 센싱 요소로 활용될 수 있음을 보여준다.
제안 방법
이러한 문제의 대안으로 표지 분자를 결합시킨 융합 파아지 단백질들이 시도되고 있다[6, 22]. Cysteine 표지 P22 파아지 수용체 결합 단백질로 S. typhimurium [22]을, glutathione-S-transferase와 파아지 NCTC 12673의 융합 단백질로 C. jejuni [13, 23]을 검출하였다. 람다 파아지 꼬리 단백질 J의 유전분석에 의하면 C 절편이 E.
Dot blot을 통해 일차적으로 정제 단백질과 다른 미생물들과의 결합여부를 조사하였다(Fig. 3). 열로 사멸시킨 세포들(E.
p6HN-J 플라스미드를 포함하는 E. coli BL21 (DE3) 세포를 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)로 과발현하고 HisTALON 정제 키트로 정제하였다.
마지막으로 정제 단백질과 숙주세포의 표면 리셉터와의 결합이 람다 파아지의 숙주세포 흡착에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다(Fig. 4). E.
coli K-12, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa)을 연속적으로 희석(100, 10-1 and 10-2)하여 니트로셀룰로스 막에 2 μl씩 찍은 후 건조시키고, blocking 용액, 6HN-J 단백질(또는 1% BSA in PBS) 용액에서 각 1시간 37℃에서 흔들며 두었다. 막을 blocking 용액으로 씻은 후 Western blot과 같이 Horseradish Perosidase가 결합된 anti-His 단클론 항체(diluted 1: 1,000-20,000 in blocking)용액, 그리고 기질과 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출하였다.
세포를 10,000× g에서 5분간 원심분리하여 상층액과 침전층으로 나누었다.
세포를 정제된 6HN-J 단백질(0.01, 0.1, 1, 10, 25 μg/ml)용액에 1시간 37℃에서 둔 후 람다 파아지(500 PFU 되게 SM/젤라틴 용액으로 희석)와 20분간 배양하였다.
열로 사멸시킨 세포들(E. coli K-12, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa)을 연속적으로 희석하고 니트로셀루로스 막에 2 μl씩 찍어 건조한 후 blocking 용액으로 처리하고 정제 단백질(또는 BSA)과 결합시켰다.
람다 파아지 꼬리 유전자 J (잔기 784~1,132)를 주문 제작한 프라이머로 증폭하였다. 정제한 PCR 산물(약 1,000 bp)을 IPTG로 유도 가능한 T7lac 촉진유전자를 포함하는 발현벡터 (pET 6XHN-N)에 도입하여 J의 N-말단이 6X His-tag와 결합 (p6HN- J)되게 한 후 E. coli BL21 (DE3) 세포에 형질전환하였다. 6HN-J 단백질은 침전물로 과발현되며 정제 단백질은 약 38 kDa로 관찰되었다(Fig.
파아지 DNA는 키트 매뉴얼대로 정제하여 SacI과 HindIII를 각 말단에 가지는 primers (forward 5'-AAG GCC TCT GTC GAC GAT TAT TAC TTT TAT ATC CGC-3', reverse 5'-AGA ATT CGC AAG CTT TCA GAC CAC GCT GAT GCC CAG-3')로 PCR 증폭하였다.
5% NaCl), 37℃에서 키웠다. 플라크 시험(PFU)는 연속적으로 희석한 파아지를 E. coli K-12와 함께 20분간 섞은 다음 soft overlay 방법으로 LB agar에서 24시간 키운 후 확인하였다.
대상 데이터
E. coli BL21(DE3) (hsdS, gal, ëclts857, ind1, sam7, nin5, lacUV5-T7gene1)는 6HN-J 단백질의 과발현을 위해 사용하였다.
E. coli DH5α (hsdR, recA, Thi-1, relA1, gyrA96)는 플라스미드 유지를 위해 사용하였다.
coli DH5α (hsdR, recA, Thi-1, relA1, gyrA96)는 플라스미드 유지를 위해 사용하였다. E. coli K-12, Salmonella typhimurium x3339, Bacillus subtilis KCTC3135/ATCC6051, and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에서 구입하였다. E.
pET 발현 및 정제 키트 (in-Fusion Ready)는 Clonetech (CA, USA)에서 구입하였다. Horseradish Peroxidase (HRP)와 결합된 anti-His 단클론 항체와 Horseradish Perosidase 기질은 TaKaRa Clontech (CA, USA)에서 구입하였다. 본 연구에서 사용한 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
배지 성분은 Difco (MO, USA)에서, 바이러스 DNA 분리 키트는 Macherey-Nagel (Düren, Germany)에서, 겔 추출 및 플라스미드 분리 키트는 Qiagen (Hilden, Germany)에서 주문하여 사용하였다. SalⅠ, HindⅢ, Taq 중합효소, T4-DNA 리가제 는 TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하였다. pET 발현 및 정제 키트 (in-Fusion Ready)는 Clonetech (CA, USA)에서 구입하였다.
1). 람다 파아지 꼬리 유전자 J (잔기 784~1,132)를 주문 제작한 프라이머로 증폭하였다. 정제한 PCR 산물(약 1,000 bp)을 IPTG로 유도 가능한 T7lac 촉진유전자를 포함하는 발현벡터 (pET 6XHN-N)에 도입하여 J의 N-말단이 6X His-tag와 결합 (p6HN- J)되게 한 후 E.
배지 성분은 Difco (MO, USA)에서, 바이러스 DNA 분리 키트는 Macherey-Nagel (Düren, Germany)에서, 겔 추출 및 플라스미드 분리 키트는 Qiagen (Hilden, Germany)에서 주문하여 사용하였다.
Horseradish Peroxidase (HRP)와 결합된 anti-His 단클론 항체와 Horseradish Perosidase 기질은 TaKaRa Clontech (CA, USA)에서 구입하였다. 본 연구에서 사용한 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
이론/모형
coli BL21 (DE3)에 형질전환하였다. 클로닝 관련 모든 방법은 표준 방법대로 수행하였다[17].
파아지 람다는 CsCl 농도구배 원심분리 방법[17]으로 정제하였다. 파아지 DNA는 키트 매뉴얼대로 정제하여 SacI과 HindIII를 각 말단에 가지는 primers (forward 5'-AAG GCC TCT GTC GAC GAT TAT TAC TTT TAT ATC CGC-3', reverse 5'-AGA ATT CGC AAG CTT TCA GAC CAC GCT GAT GCC CAG-3')로 PCR 증폭하였다.
성능/효과
결론적으로, 6HN-J 단백질은 E. coli K-12 세포에 특이적으로 반응하여 앞으로 surface plasmon resonance (SPR) platform의 센싱 요소(e.g., protein chips)로 활용 가능하며 환경과 식품에서 목표 미생물의 특이적, 선별적, 그리고 실시간 모니터링에 활용될 수 있는 큰 가능성을 보여주었다.
그러나, 정제단백질 또는 BSA 처리한 다른 미생물들과의 특이 반응은 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과는 정제된 6HN-J 단백질이 E. coli K-12에 결합하나 다른 Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa와 결합하지 않음을 나타내어 정제 단백질의 센싱 요소로서의 탁월한 선택성을 제시한다.
후속연구
coli K-12와의 결합이 in vivo 파아지 흡착에 미치는 영향도 조사하였다. 본 연구 결과는 미생물검출에서 파아지 융합 단백질이 신속하고 신뢰할 수 있는 센싱 요소로 활용될 수 있음을 보여준다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
박테리오파아지의 특징은 무엇인가?
박테리오파아지는 보편성, 신뢰도, 빠른 반응성, 안전성으로 미생물 검출에서 뛰어난 생물 센싱 요소로 흥미를 끌고 있다[24]. 파아지는 꼬리 단백질을 특별한 숙주 박테리아 표면의 수용체와 결합하여 숙주를 감염하므로 이러한 특성은 박테리아의 분류에도 활용된다[6].
표지 분자를 결합시킨 융합 파아지 단백질들은 어떤 문제의 대안으로 시도되고 있는가?
또한 파아지는 자연에 널리 존재하므로 열악한 환경(온도, pH, 이온강도 등)에서도 잘 견딘다. 온전한 파아지를 센싱 요소로 활용하여 E. coli [21], S. aureus [2], B. anthracis spores [9] 등의 일부 미생물을 검출하는 시도가 있었다. 그러나 온전한 파아지는 숙주를 용해(lysis)하 고 건조시키는 단점을 가지고 있다[22]. 어떤 파아지는 효소 활동을 가지며 숙주 표면 단백질을 분해하여 바이오센서 신호의 불안정성을 초래한다. 또한 온전한 파아지는 비교적 큰 크기로 거리에 의존하는 센싱 플랫폼(예, surface plasmon resonance)에는 적절히 반응하지 않는다[24]. 이러한 문제의 대안 으로 표지 분자를 결합시킨 융합 파아지 단백질들이 시도되고 있다[6, 22].
바이오센서는 어떤 장점을 갖고 있는가?
대안으로 부각되는 바이오센서는 이러한 문제점들을 극복할 가능성을 보여주고 있다. 바이오센서는 높은 민감도와 선택성, 신속성, 비용 효율성, 소형화 및 현장 검출 이동성 등 의 장점을 가지고 있다[3]. 많은 종류의 바이오센서가 다양한 환경오염물질들[3, 5, 19]과 미생물[1, 11, 24] 검출에 활용되고 있다.
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