선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 가열처리 시간의 증가에 따라 심황색소로 부터의 H2O2 생성능이 증가한 반면, 정상장관계 세포 INT 407 및 대장암 세포 HCT 116를 대상으로 한 세포독성평가에서는 가열처리 후 심황색소의 활성이 유의적으로 약화되었다. 본 연구결과는 다양한 가공식품에 첨가되는 심황색소의 화학안정성 및 생리활성이 가열처리에 의해 크게 영향을 받으며, 생리활성 증진을 목적으로 첨가되는 심황색소에 이러한 가열처리 효과가 고려되어야 함을 시사한다.
- 본 연구에서는 식품의 가공이나 조리 시 빈번히 적용되는 가열처리에 의한 심황색소의 화학안정성, 산화방지활성 및 세포독성의 변화를 조사하였다. 95℃에서 각 시간별로 가열처리한 심황색소는 가열시간이 증가할수록 발색도가 감소하였으며, 형광도는 초기 가열 시에 증가하다 감소하는 양상을 보였다.
제안 방법
- AAPH peroxyl 라디칼 소거활성 측정을 위하여, 인산완충생리식염수(phosphate buffered-saline, PBS, pH 7.4)로 희석한 1 μg/mL의 시료 60 μL와 0.5 μM fluorescein sodium salt 100μL을 혼합한 후 20 mM AAPH peroxyl 라디칼 40 μL를 가하여 반응을 개시 하였다.
- 모든 실험결과는 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타냈고, 각 실험 군 별 유의차는 Student’s t-test 또는 일원배치 분산 분석(one-way ANOVA)과 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다. AAPH peroxyl 라디칼의 반감기(half life)와 세포독성의 IC50값은 각 결과로부터 직선부위에 대한 선형회귀식을 구하고 50% 라디칼 소거 또는 50% 세포가 생존하는 농도를 계산하였다.
- 1의 흡광도를 갖는 DPPH 메탄올 용액 100 μL를 혼합하여 상온의 암소에서 30분 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼을 생성시키기 위해 10mM ABTS와 10 mM potassium persulfate를 각각 7.4:2.6 (v/v) 비율로 혼합한 후 상온의 암소에서 24시간 방치시켰다. 이후 734nm에서 흡광도가 0.
- Changes in chromatograms (A) and residual levels (B) of each curcuminoid by heating at 95℃ with different treatment time were analyzed using HPLC.
- DPPH 라디칼 소거활성을 측정하기 위해 각 조건에서 처리한 색소시료 100 μL와 0.8±0.1의 흡광도를 갖는 DPPH 메탄올 용액 100 μL를 혼합하여 상온의 암소에서 30분 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 형광방출 스펙트럼의 변화는 각 시료를 440 nm에서 excitation 시킨 후 350-750 nm에서 측정하였다. 가열에 의한 쿠쿠민, DMC, BMC 등 각각의 쿠쿠미노이드량의 변화는 HPLC (Agilent 1100 Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)로 분석하였다. 이동상은 1% citric acid를 첨가한 THF-water (40:60, v/v)를 포화 수산화포타슘(KOH) 용액으로 pH 3으로 조절한 후 여과와 기포 제거처리를 하여 제조하였다.
- 대장암세포주 HCT 116과 정상 장관계 세포주 INT 407을 대상으로 가열처리에 의한 심황색소의 세포독성 변화를 평가하였다. 가열처리를 통하여 약 50% 파괴시킨 색소시료와 처리 전 시료를 농도 별로 세포에 투여하고 MTT assay에 의해 세포생존율을 측정하였다. 심황색소는 전반적으로 정상 장관계 INT 407 세포주에 비해 대장암 HCT 116 세포주에 더 강한 세포독성을 나타냈다(Fig.
- 가열처리에 따른 심황색소의 산화방지활성 변화는 DPPH, ABTS, AAPH peroxyl radical 및 아질산염에 대한 소거능으로 평가하였다. 가열처리 전의 심황색소(40 μg/mL)는 ABTS 라디칼에 대해서 약 40%의 소거활성을 나타냈으며, 95℃에서 15분 이상 가열한 시료에서 그 활성이 유의적으로 증가하였다.
- 가열처리에 의한 심황색소로 부터의 H2O2 생성량 변화는 ferrous oxidation-xylenol orange (FOX) assay를 일부 변형하여 측정하였다(17). 각 조건에서 처리된 40 μg/mL의 심황색소를 PBS에 20 μg/mL이 되도록 희석하고 37℃ 암소에서 3시간동안 방치한 후 측정하였다.
- 가열처리에 의한 심황색소의 화학적 변화를 흡광도와 형광특성을 통해 분석하였다. 95℃에서 각 시간별로 가열처리한 시료(40 μg/mL)의 흡수 스펙트럼은 노란색에 특이적인 400-450 nm 부근에서 최대 흡광영역을 나타냈으며 가열시간이 증가할수록 피크(peak)를 포함한 해당영역의 흡광도가 전반적으로 저하되었다 (Fig.
- 각 반응액 또는 배양액 160 μL에 100 μM xylenol orange, 200 mM D-소비톨(sorbitol), 및 500 μM ammonium ferrous sulfate이 혼합된 반응용액 40 μL를 가해 상온에서 45분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 농도에 따른 색소의 파괴속도 변화를 평가하기 위해 모든 농도의 시료는 가열처리 후 40 μg/mL이 되도록 증류수로 희석하여 측정하였으며, 화학적 변화 및 산화방지 활성 변화에 대한 평가는 40 μg/mL의 농도에서 가열처리한 색소를 희석하여 사용하였다.
- 대장암세포주 HCT 116과 정상 장관계 세포주 INT 407을 대상으로 가열처리에 의한 심황색소의 세포독성 변화를 평가하였다. 가열처리를 통하여 약 50% 파괴시킨 색소시료와 처리 전 시료를 농도 별로 세포에 투여하고 MTT assay에 의해 세포생존율을 측정하였다.
- 지금까지 여러 가공조건에 의한 쿠쿠민의 발색도의 감소 및 가열산물의 산화방지활성 평가 등에 대한 선행연구들이 보고 되었으나(14-16), 심황자체 또는 쿠쿠민 화합물에 대한 직접적인 처리가 대부분이며 실제 식품에 빈번히 적용되는 심황색소에서의 가열처리에 의한 안정성을 비롯한 화학적 특성 변화 및 생리활성의 변화는 거의 연구된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 심황색소를 이용하여 식품 가공공정이나 조리과정 중에 빈번히 적용되는 가열처리를 통하여 3종의 쿠쿠미노이드인 쿠쿠민, DMC 및 BMC의 안정성의 변화를 측정하였으며 이에 따른 산화방지활성과 세포독성 등의 생리활성 변화를 분석하였다.
- 분석컬럼은 HPLC packed column C18 (4.6 mm ID. 150 mm×5 μm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용 하였으며, 30℃로 컬럼온도를 고정하고 20 μL의 시료를 주입하여 1 mL/min 유속으로 분석하였다.
- 세포독성 평가를 위해서는 500 μg/mL 심황색소를 위와 동일한 방법으로 약 50% 파괴될 때까지 가열처리 하였고 이를 무혈청(serum free) 배지에 농도별로 희석하여 세포에 처리하였다.
- 각 조건에서 처리된 40 μg/mL의 심황색소를 PBS에 20 μg/mL이 되도록 희석하고 37℃ 암소에서 3시간동안 방치한 후 측정하였다. 세포배양액 상의 H2O2 생성량은 각 시료를 세포주 HCT 116과 INT 407에 처리하고 정규배양 조건에서 24시간 배양한 후, 배지를 거두어 분석하였다. 각 반응액 또는 배양액 160 μL에 100 μM xylenol orange, 200 mM D-소비톨(sorbitol), 및 500 μM ammonium ferrous sulfate이 혼합된 반응용액 40 μL를 가해 상온에서 45분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 mL e-tube에 분주한 후 95℃의 블록히터(Block heater Type 17600, Thermoylone, Dubuque, IA, USA)에서 가열시간을 달리하여 처리하였다. 시료는 처리 후 즉시 얼음 위에서 냉각시켰고, 가열 중에 증발되는 수분을 고려하여 가열 전과 가열 후 무게 차이를 구한 후 이에 해당하는 증류수를 가하여 농도를 일정하게 유지하였다. 농도에 따른 색소의 파괴속도 변화를 평가하기 위해 모든 농도의 시료는 가열처리 후 40 μg/mL이 되도록 증류수로 희석하여 측정하였으며, 화학적 변화 및 산화방지 활성 변화에 대한 평가는 40 μg/mL의 농도에서 가열처리한 색소를 희석하여 사용하였다.
- 심황색소를 증류수에 각 농도별로(40-640 μg/mL) 희석하고 0.5mL씩 1.5 mL e-tube에 분주한 후 95℃의 블록히터(Block heater Type 17600, Thermoylone, Dubuque, IA, USA)에서 가열시간을 달리하여 처리하였다.
- 심황색소의 발색특성 변화는 마이크로플레이트판독기(Microplate reader Spectra Max M3, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도와 400-800 nm에서 흡수 스펙트럼으로 분석하였다. 형광특성은 excitation 440 nm와 emission 535 nm 파장에서 분석하였으며 530 nm 이하의 빛은 차단하였다.
- 아질산염(nitrite) 소거활성은 0.1 N HCl로 희석한 NaNO2 25 μL에 시료 125 μL에 가한 후 37℃의 암소조건에서 60분 반응시킨 후 감소된 아질산염양의 차이로 평가하였다.
- 이 후 serum free 배지에 희석한 0.5 mg/mL MTT를 well당 100 μL씩 가하여 약 30-40 분간 반응시키고, 살아있는 세포에 의해 생성된 MTT formazan을 DMSO 100 μL로 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다(Spectra Max M3).
- 가열에 의한 쿠쿠민, DMC, BMC 등 각각의 쿠쿠미노이드량의 변화는 HPLC (Agilent 1100 Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)로 분석하였다. 이동상은 1% citric acid를 첨가한 THF-water (40:60, v/v)를 포화 수산화포타슘(KOH) 용액으로 pH 3으로 조절한 후 여과와 기포 제거처리를 하여 제조하였다. 분석컬럼은 HPLC packed column C18 (4.
- 쿠쿠미노이드는 자체의 광화학적 특성으로 인해 형광을 나타내는 것으로 보고되었는데(18), 이에 가열처리가 미치는 심황색소의 형광특성 변화를 분석하였다. 440 nm파장에서 자극시킨 심황색소는 510-650 nm의 비교적 넓은 파장에서 형광방출이 일어났으며, 가열시간의 증가에 따라 방출파장의 피크가 다소 단파장 쪽으로 이동되는 경향을 나타냈다.
- 한편 쿠쿠미노이드와 같은 폴리페놀성 물질 중에 상당수가 세포배양계에서 활성산소종을 생성하는 산화촉진제(pro-oxidant)로 작용하여 세포성장과 사멸에 영향을 미치는 것으로 보고됨에 따라(25-28), 가열처리에 의한 심황색소로부터의 활성산소종 생성량 변화를 분석하였다. 심황색소를 시간 별로 가열처리하고 PBS상에서 3시간 동안 방치한 후 H2O2의 생성량을 분석한 결과, 가열처리 시간이 증가할수록 생성능이 유의적으로 강화되는 결과를 나타냈다(Fig.
대상 데이터
- 심황색소(oleoresin turmeric, 심황색소로서 100%, 색가 6500 CU, 쿠쿠미노이드 40%)은 ES ingredients (Gunpo, Korea)에서 구입하였다. HPLC 분석용 용매 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF)은 J.T. Baker Co. (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며 3-(-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. 인간 형질전환 정상장관계 세포주 INT 407과 인간 대장암 세포주 HCT 116는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양 받았다.
- 심황색소(oleoresin turmeric, 심황색소로서 100%, 색가 6500 CU, 쿠쿠미노이드 40%)은 ES ingredients (Gunpo, Korea)에서 구입하였다. HPLC 분석용 용매 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF)은 J.
- 심황색소의 세포독성은 인간 대장암 세포주인 HCT 116과 인간 정상장관계 세포주인 INT 407세포를 이용하여 평가하였다. 각 세포를 96 well plate에 well당 1.
- 인간 형질전환 정상장관계 세포주 INT 407과 인간 대장암 세포주 HCT 116는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양 받았다. 이 외에 실험에 사용한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며 3-(-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. 인간 형질전환 정상장관계 세포주 INT 407과 인간 대장암 세포주 HCT 116는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양 받았다. 이 외에 실험에 사용한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Co.
- 심황색소의 발색특성 변화는 마이크로플레이트판독기(Microplate reader Spectra Max M3, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도와 400-800 nm에서 흡수 스펙트럼으로 분석하였다. 형광특성은 excitation 440 nm와 emission 535 nm 파장에서 분석하였으며 530 nm 이하의 빛은 차단하였다. 형광방출 스펙트럼의 변화는 각 시료를 440 nm에서 excitation 시킨 후 350-750 nm에서 측정하였다.
데이터처리
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (in C).
- Significant differences from control or # between initial and heating sample according to Student’s t-test (*, #p<0.05, **p<0.01).
- Significant differences from control were determined by Student’s t-test (**p<0.01).
- Significant differences from control were determined by Student’s t-test (*p<0.05, **p<0.01 in A and B).
- Significant differences from fresh control were determined by Student’s t-test (*p<0.05, **p<0.01).
- 모든 실험결과는 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타냈고, 각 실험 군 별 유의차는 Student’s t-test 또는 일원배치 분산 분석(one-way ANOVA)과 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다.
이론/모형
- AAPH peroxyl 라디칼에 대한 소거능은 ORAC (oxygen radical absorbance capacity) assay를 통해 평가하였다. 본 반응계에서는 자유라디칼 initiator인 AAPH가 peroxyl 라디칼을 생성하여 플루오레세인(fluorescein)의 형광도를 감소시키게 되는데 이 반응계에 라디칼을 소거하는 물질이 있을 경우 플루오레세인의 형광감소를 지연시키게 된다(19).
성능/효과
- 본 연구에서는 식품의 가공이나 조리 시 빈번히 적용되는 가열처리에 의한 심황색소의 화학안정성, 산화방지활성 및 세포독성의 변화를 조사하였다. 95℃에서 각 시간별로 가열처리한 심황색소는 가열시간이 증가할수록 발색도가 감소하였으며, 형광도는 초기 가열 시에 증가하다 감소하는 양상을 보였다. HPLC 분석결과 3종의 쿠쿠미노이드 중 쿠쿠민이 가열처리에 가장 민감하였으며 BMC가 가장 안정하였다.
- 95℃에서 각 시간별로 가열처리한 심황색소는 가열시간이 증가할수록 발색도가 감소하였으며, 형광도는 초기 가열 시에 증가하다 감소하는 양상을 보였다. HPLC 분석결과 3종의 쿠쿠미노이드 중 쿠쿠민이 가열처리에 가장 민감하였으며 BMC가 가장 안정하였다. 가열 처리 후의 심황색소에 의해 ABTS 라디칼, AAPH peroxyl 라디칼 및 아질산염 소거활성이 증가하였으나, DPPH 라디칼 소거활성에는 변화가 없었다.
- HPLC 분석결과 3종의 쿠쿠미노이드 중 쿠쿠민이 가열처리에 가장 민감하였으며 BMC가 가장 안정하였다. 가열 처리 후의 심황색소에 의해 ABTS 라디칼, AAPH peroxyl 라디칼 및 아질산염 소거활성이 증가하였으나, DPPH 라디칼 소거활성에는 변화가 없었다. 가열처리 시간의 증가에 따라 심황색소로 부터의 H2O2 생성능이 증가한 반면, 정상장관계 세포 INT 407 및 대장암 세포 HCT 116를 대상으로 한 세포독성평가에서는 가열처리 후 심황색소의 활성이 유의적으로 약화되었다.
- 가열 처리 후의 심황색소에 의해 ABTS 라디칼, AAPH peroxyl 라디칼 및 아질산염 소거활성이 증가하였으나, DPPH 라디칼 소거활성에는 변화가 없었다. 가열처리 시간의 증가에 따라 심황색소로 부터의 H2O2 생성능이 증가한 반면, 정상장관계 세포 INT 407 및 대장암 세포 HCT 116를 대상으로 한 세포독성평가에서는 가열처리 후 심황색소의 활성이 유의적으로 약화되었다. 본 연구결과는 다양한 가공식품에 첨가되는 심황색소의 화학안정성 및 생리활성이 가열처리에 의해 크게 영향을 받으며, 생리활성 증진을 목적으로 첨가되는 심황색소에 이러한 가열처리 효과가 고려되어야 함을 시사한다.
- 가열처리 전의 심황색소(40 μg/mL)는 ABTS 라디칼에 대해서 약 40%의 소거활성을 나타냈으며, 95℃에서 15분 이상 가열한 시료에서 그 활성이 유의적으로 증가하였다.
- 3A). 가열처리를 하지 않은 색소와 비교하였을 때, 95℃에서 10분과 15분간 가열 시 쿠쿠민이 각각 56.8와 88.1%가 파괴되어 가열처리에 가장 민감하였으며, 15분간 가열 시 DMC는 62.57%, BMC는 22.73%가 파괴되어 3종의 쿠쿠미노이드 중 BMC가 가열에 의한 화학안정성이 가장 뛰어났다(Fig. 3B and C). 이상의 결과는 페놀고리 구조 상의 메톡실기가 가열처리에 대한 쿠쿠미노이드의구조적 안정성을 저하시키는 요인으로 작용하며, 또한 쿠쿠미노이드 분자의 전반적인 소수성 성질의 증가가 수용액 상태에서의 가열에 대한 저항성을 갖게 하기 때문으로 판단된다.
- 가열처리에 따른 심황색소(1 μg/mL)의 AAPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 가열시간의 증가에 따라 AAPH 라디칼에 의한 형광도의 감소가 유의적으로 지연되었다(Fig. 4C).
- 4C). 각 시료별 반감기를 계산한 결과, 대조구의 경우 AAPH라디칼에 의한 형광도의 반감기가 52.1분이었고 심황색소에 대한 가열시간의 증가에 따라 반감기가 증가하여 15분 가열시료에서는 87.4분까지 연장되었다(Fig. 4D).
- 각 심황색소 시료를 HCT 116과 INT 407 세포배양계에 24시간 처리한 후 세포배양액 상의 H2O2생성량을 측정한 결과, HCT 116에서는 검출한계 이하였으며 INT 407에서는 가열 전 심황색소에서 약간 더 많은 량의 H2O2가 생성되었지만 2 μM 이하의 극히 미미한 수준이었다(Fig. 6B).
- 5). 두 세포에서 모두 가열처리를 한 심황색소 시료의 세포독성이 현저하게 약화되었으며(Fig. 5A and B), IC50값에서도 유의적인 차이를 나타냈다(Fig. 5C).
- 이러한 현상은 이 영역에서 최대흡광도를 나타내는 쿠쿠미노이드류가 가열처리에 의해 파괴되고, 가열시간이 증가함에 따라 그 잔류량이 감소하였기 때문으로 판단된다. 따라서 405 nm에서 흡광도를 통하여 심황색소의 발색도의 변화를 측정한 결과, 가열시간에 의존적으로 발색도가 감소하였으며 15분 및 30분 가열처리 된 시료에서 각각 46.1과 23.9%의 잔류 발색도를 나타내었다(Fig. 1B). 한편 가열에 의한 색소의 파괴속도는 농도가 증가할수록 지연되는 현상을 나타냈는데, 30분간 가열 시 40 μg/mL의 시료에서 색소 잔류량은 24.
- 1C). 본 결과는 심황색소가 함유된 식품의 가열처리 시 색소농도를 증가시킬 경우 가열에 의한 손실을 상당 부분 방지할 수 있음을 시사한다.
- 본 실험에 사용된 심황색소는 총 40.34%의 쿠쿠미노이드를 함유하고 있었으며, 본 HPLC 시스템에서 3종의 쿠쿠미노이드는 쿠쿠민, DMC 및 BMC 순으로 검출되었고 쿠쿠민, DMC 및 BMC가 각각 59.7, 21.5 및 18.8% (w/w)의 함량을 나타내었다(Fig. 3).각 쿠쿠미노이드에 의한 피크는 전반적으로 가열시간이 증가함에 따라 높이와 면적이 감소하는 양상을 나타내었다(Fig.
- 본 연구결과에 의하면 가열처리에 의한 쿠쿠미노이드의 파괴에도 불구하고, 각종 라디칼 및 아질산염에 대한 소거활성은 감소하지 않는 것으로 나타났다. 오히려 DPPH 라디칼 소거활성을 제외하고 대부분의 반응계에서 활성이 증가되었는데, 이는 가열처리에 의해 생성된 분해산물이 상당한 산화방지능을 가지고 있음을 시사한다.
- 가열처리를 통하여 약 50% 파괴시킨 색소시료와 처리 전 시료를 농도 별로 세포에 투여하고 MTT assay에 의해 세포생존율을 측정하였다. 심황색소는 전반적으로 정상 장관계 INT 407 세포주에 비해 대장암 HCT 116 세포주에 더 강한 세포독성을 나타냈다(Fig. 5). 두 세포에서 모두 가열처리를 한 심황색소 시료의 세포독성이 현저하게 약화되었으며(Fig.
- 한편 쿠쿠미노이드와 같은 폴리페놀성 물질 중에 상당수가 세포배양계에서 활성산소종을 생성하는 산화촉진제(pro-oxidant)로 작용하여 세포성장과 사멸에 영향을 미치는 것으로 보고됨에 따라(25-28), 가열처리에 의한 심황색소로부터의 활성산소종 생성량 변화를 분석하였다. 심황색소를 시간 별로 가열처리하고 PBS상에서 3시간 동안 방치한 후 H2O2의 생성량을 분석한 결과, 가열처리 시간이 증가할수록 생성능이 유의적으로 강화되는 결과를 나타냈다(Fig. 6A). 가열 전 심황색소에서는 7.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.